1、质粒载体的构建摘 要 ：质粒载体的构建。首先要获得目的 DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR 的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA 上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381 的 DH5 感受态细胞中复制表达。关键词： 质粒 DNA PCR 电泳 感受态 转化 1. 引言质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： 是染色质外的双链共价闭合环形 DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋
2、结构，不同质粒大小在 2-300kb 之间，15kb 的小质粒比较容易分离纯化，15kb 的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒 DNA 复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称 R 质粒，带有 R 质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的
3、人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。质粒载体 pBR322 是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体 pBR322 中的“p 代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar 和 Rogigerus 姓氏的字首，“322” 是实验编号。质粒载体 pBR322 的大小为 4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体 pBR322 的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增
4、以后，每个细胞中可累积 1000-3000 份拷贝，该特性为重组体 DNA 的制备提供了极大的方便。构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定 DNA 片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2. 材料方法2.1 目的 DNA 的获得2.1.1 引物设计第一次引物设计：正向引物： sinn3F 冰盒标注：P 2a引物序列：5 AAGCAAAATCTAACCG
5、TGTAATGTA3引物长度：25bp反向引物：sinn3R 冰盒标注：P 2b引物序列：5 GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA3引物长度：22bp第二次引物设计（带酶切位点）：正向引物： sinn3FE 冰盒标注：P 2c引物序列：5 ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA3引物长度：34bp反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P 2d引物序列：5 TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT3引物长度：34bp2.1.2 PCR 扩增2.1.2.1 PCR 技术的基本原理 PCR 即聚合酶链式反应,是指在 DNA 聚合酶的催
6、化下,以母链 DNA 为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等步骤,体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA的过程.是一项 DNA 体外合成放大技术,可用于基因分离克隆 ,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面.PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2PCR 反应的基本步骤:1.变性: 高温使双链 DNA 解离成单链.（94 30s）2.退火:低温下引物与模板 DNA 互补区结合形成杂交分子 .（55 30s） 3.延伸:中温延伸. 在 DNA 聚合酶、dNTP、Mg 2+存在下, DNA 聚合酶催化以引物为起
7、始点的 DNA 链 5向 3方向的延伸,合成出与模板 DNA 链互补的 DNA 子链. （70-72 30-60s）以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过 n 次循环后,目的 DNA 以 2n 形式增加.2.1.2.2 PCR 检测PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法2.1.2.3 PCR 反应体系第一次 PCR 扩增:调整 PCR 反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复
8、试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的 DNA 电泳条带（1kb）:PCR 反应体系 2*100ul（每管 25ul,共 8 管）Pyrobest 2ulbuffer（10x） 10ulWT4（模板） 2ulP2a（10uM） 4ulP2b（10uM） 4uldNTP（2.5x） 2ulddH2O 76ulPCR 反应条件:94 5min30 cycles: 94 40s53 40s72 2min30s72 10min4 forever将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见 2.1.3 电泳）,切胶回收目的 DNA 条带,共切 3 管,分别标注 A、B、C.首先用 25ul 约60的无菌蒸馏
9、水洗脱 A 管一次,洗脱液标注 1,分别用 15ul 的无菌蒸馏水洗脱 B 管和 C 管,得到的 DNA 洗脱液标注 2,最后各用 30ul 的无菌蒸馏水洗脱 A、B、C 管,得到的 DNA 洗脱液分别标注 a、b、c.第二次 PCR 扩增（带酶切位点）:分别用 DNA 的洗脱液 2、a、b、c 为模板,进行第二次 PCR扩增,设计反应体系（各 25ul）如下:模板 2 模板 a 模板 b 模板 c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ulbuffer（10x） 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul模板 0.5ul 2ul 4ul 6ulP2a（10uM） 1
10、ul 1ul 1ul 1ulP2b（10uM） 1ul 1ul 1ul 1uldNTP（2.5x） 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ulddH2O 19ul 17.5ul 15.5ul 13.5ulPCR 反应条件:94 5min30 cycles: 94 40s54 40s72 2min30s72 10min4 forever电泳结果表明:以 2 管和 c 管为模板可得到明显的目的基因条带,依据此次电泳结果,可先后再利用 PCR 扩增（各 100ul,每管 25ul,共 8 管）PCR 反应体系 2*100ul（每管 25ul,共 8 管）模板 2 模板 c Pyrobest 2u
11、l 2ulbuffer（10x） 10ul 10ul模板 4ul 40ulP2a（10uM） 4ul 4ulP2b（10uM） 4ul 4uldNTP（2.5x） 2ul 2ulddH2O 74ul 38ulPCR 反应条件:94 5min30 cycles: 94 40s54 40s72 2min30s72 10min4 forever电泳条带明显而且明亮,切胶回收保存待用.。2.1.3 电泳2.1.3.1 配胶 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（1X TAE Buffer） 根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉（1g）,加入适当的锥形瓶中。 加入一定量的电泳缓冲液（1X TAE Buffe
12、r 100ml） 。 熔化完全，冷却至 600C 左右，加入 EB5-7ul，充分混匀。 将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。 室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放40C保存，一般可保存 2-5 天。2.1.3.2 电泳取适量的 PCR 产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的 DNA Maker 加入右边槽中，开始电泳。2.1.3.3 紫外观察电泳条带当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带（1kb 处）2.1.4 切胶回收目的 DNA切胶回收目的 DNA 的方法步骤：操作流程见右图，全套操作约需 30 分钟，详细说明如下。1. 使用 TA
13、E 缓冲液或 TBE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。2. 在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。注）切胶时请注意不要将 DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止 DNA 损伤。3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤 6 的胶块融化时间，提高 DNA 的回收率。4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以 1 mg=1 l 进行计算。5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表： 6. 均匀
14、混合后 75加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在 45加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约 610 分钟）。注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA的回收率。7. 向上述胶块融化液中加入 DR-I Buffer 量的 1/2 体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。凝胶浓度 DR-I Buffer 使用量1.0% 3 个凝胶体积量1.0%1.5% 4 个凝胶体积量1.5%2.0% 5 个凝胶体积量
15、9. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中，3,600 rpm 离心 1 分钟（如 Spin Column 中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心 1 分钟），弃滤液。注）如将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。10.将 500 l 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，3,600 rpm 离心 30 秒，弃滤液。11.将 700 l 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，3,600 rpm 离心 30 秒，弃滤液。12.重复操作步骤 11，然后 12,000 rpm 再离心 1 分钟。13.将 Sp
16、in Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 25 l 的 60 水或洗脱液，室温静置 1 分钟。14.12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。 2.1.5 目的 DNA 加尾用 25ul 的无菌蒸馏水洗脱 DNA，再用 20ul 的无菌蒸馏水洗脱，共得约 40ul 的洗脱液，然后抽真空使其浓缩至约 8ul。加尾 10ul 体系： 8ul DNA1ul Buffer（10x）0.5ul dATP0.5ul Taq 酶PCR 条件：72 30-40min 降至 4即可 2.1.6 连接 T-DNA连接 10ul 体系： 1 ul
17、T4 ligase1 ul Buffer（10x）1 ul T-DNA7 ul DNA-PolyA连接条件： 4000rpm 甩 30sec 4过夜2.2 感受态 DH5 的制备2.2.1 基本原理转化是将外源 DNA 分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性状. 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,可以容忍外源的 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代,受体细胞经过一些特殊的方法,如电击、C aCl2等化学试剂处理后,细胞膜的通透性增加,成为感受态细胞,使外源的 DNA 分子可以进入.2.2.2 方法步骤目前常用的感受态细胞制备方法有电击法和 CaCl2法
18、, 电击法制备效率较高,但 CaCl2法简单易行,且其转化效率可以满足一般的实验要求,因此 CaCl2法使用更为广泛.CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤:准备: （1） 配制 0.05mol/l 的 CaCl2-15的甘油混合溶液,高温高压灭菌. 注: C aCl2必须为分析纯以上,（2） 实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌. 注:最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材.（3）受体菌的培养:从非选择性 LB 培养基上挑取 E.coli 单菌落,接种于 3-5ml LB 液体培养基中, 37振荡培养过夜至对数生长期中后期.将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50-100ml LB 培养基中,
