1、人 组织多肽抗原 (TPA)酶联免疫分析 （ ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定 人 血清，血浆及相关液体样本中 人 组织多肽抗原 (TPA)含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 人 组织多肽抗原 (TPA)水平。用纯化的 人 组织多肽抗原 (TPA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 组织多肽抗原(TPA)，再与 HRP 标记的 组织多肽抗原 (TPA)抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP酶的催化下转化成 蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色
2、的深浅和样品中的 组织多肽抗原 (TPA)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中 人 组织多肽抗原 (TPA)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存 说明书 1 份 1 份 封板膜 2 片 (48) 2 片 (96) 密封袋 1 个 1 个 酶标包被板 148 196 2-8 保存 标准品 0.5ml1 瓶 0.5ml1 瓶 2-8 保存 标准品稀释液 1.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 2-8 保存 酶标试剂 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 样品稀释液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 显
3、色剂 A 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 显色剂 B 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 终止液 3ml1 瓶 6ml1 瓶 2-8 保存 浓缩洗涤液 (20ml20 倍 )1 瓶 (20ml30 倍 )1 瓶 2-8 保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择 EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清，保存
4、过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。检测细胞内 的成份时，用 PBS（ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后
5、，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余 冷冻备用。 操作步骤： 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50l 弃掉，
6、再各取 50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l，混匀后从第九第十孔中各取 50l 弃掉。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.
7、温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 4. 配液：将 30（ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀， 37避光显色 15分钟 . 10. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序
8、测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 注意事项： 1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后乘
9、以总稀释倍数（ n 5）。 5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6 底物请避光保存。 7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 计算： 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应 的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 保存条件及有效期： 1.试剂盒保存：； 2-8。 2有效期： 6 个月
