1、桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告1生料酿酒工艺研究学生姓名：韦尚徐 指导教师：李海云，李子院摘要：生料酿酒就是微生物利用生淀粉直接进行生长、繁殖及代谢的过程犤犦。在这个过程中，首先微生物利用自身所产的生酶将生淀粉转化成葡萄糖，提供微生物生长、繁殖所需要的能量，同时在酒化酶的作用下，将葡萄糖转化成酒精，排出细胞外的过程。生料酿酒工艺与传统发酵酒精工艺。关键词：生料酿酒；大米；糖化；发酵Technology of liquor-making with uncooked materialsStudent: WEI Shang-xu Teacher: LI Hai-yun LI
2、Zi-yuan Abstract: Is microorganisms with uncooked materials using raw starch directly to the growth, reproduction and metabolism process of 迥 迥 1. In this process, first of all produced by microorganisms using their own living enzyme will raw starch into glucose and provide the energy needed to micr
3、obial growth, reproduction, and at the same time, under the action of the zymase glucose into alcohol, the process of the discharge cells. Technology with traditional alcohol fermentation with uncooked materials process.Key words: Liquor-making with uncooked materials; rice; saccharification; fermen
4、tation桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告2前 言随着当前经济的不断发展，我国酒类市场有不断扩大的趋势，人们对各种食用酒精、蒸馏酒、发酵酒的数量和质量的要求都有很大的提高，从而推动了酿酒行业的不断发展，同时由于节能和环保的需求，酿酒的生产方法也有了很大的进步，除了传统的高温蒸煮发酵酿酒技术，生料免蒸煮酿酒技术应运而生。生料酿酒工艺与传统酿酒工艺比较，具有节约能源，提高出酒率，操作简便，便于工业化生产等优点，被誉为我国酿酒工业发展的方向 1。生料酿酒是微生物利用生淀粉直接进行生长、繁殖及代谢的过程2。在这个过程中, 首先微生物利用自身所产的酶将生淀粉转化成葡萄糖, 提供微
5、生物生长、繁殖所需要的能量。同时在酒化酶的作用下, 将葡萄糖转化成酒精, 排出细胞外。加水糖化发酵、蒸馏而成，其特点是采用生原料，不经蒸煮糊化，不需配糟，整个发酵过程是在液态中进行。此法具有投资省，操作简便，清洁卫生，出酒率高的特点，效益较明显。又因为在其酿造过程中不需添加稻壳等辅料， 所以其酿酒废酒糟可直接作饲料一种营养价值较高的优质饲料。在某些地区甚至出现了以生产饲料喂猪为主、 产酒为辅的现象。总之，生料酿酒项目是特别适合在我国农村大力推广的项目。 生料酿酒工艺与传统发酵酒精工艺比较, 具有节约能源,提高出酒率, 操作简便, 便于工业化生产3 。全球性的能源危机, 使生料酿酒项目的研究愈来
6、愈迫切。 生料酒曲是一种含有多菌种、多酶系的复合霉曲,它具有较强的糖化力、发酵力。运用现代生物工程手段,采用具有高生淀粉分解力的优良活性酵母、生香酵母进行纯种培养、分别制曲, 再和多种酿酒酶系混合配制而成, 它含有糖化淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等较全面的酿酒酶系和活性酵母、生香酵母等多种菌系。 可用于生料酿酒的原料多种多样，大米、玉米、高粱、小麦、粉渣、青稞、小米、薯干均可。原料不同，工艺也不尽相同，本文主要探讨以大米为原料的生产工艺。 大米的淀粉含量比其它原料要高，发酵容易，出酒率高。大米质地柔软，易于糖化发酵，可免去粉碎工序，发酵周期短，单位成本较低，是生料酿酒最佳原料。 自 20 世纪 2
7、0 年代 Stamberg 等人提出。 - 淀粉酶能水解 4%10%的小麦生淀粉以来3, 各国科学家在此方面做了大量的研究工作。生料液态发酵法酿酒, 即原料+水+曲发酵蒸馏白酒。工艺流程简单, 易操作。其实质是将原料中的生淀粉直接水解, 在糖化淀粉酶和酵母的作用下直接进行酒精发酵, 蒸馏而成。它摒弃了传统白酒高温蒸煮工艺, 出酒率提高 20%，设备利用率提高 30%, 吨酒耗煤降低 35%, 单位成本大大降低, 是桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告3酿酒行业的一大突破4。 在传统操作中，熟料工艺因浸泡及蒸料时间长, 可发酵性物质损失大。据酒精生产测定, 可发酵性糖的损失随温
8、度的升高和时间的延长而增加。在温度 130e、原料颗粒直径为 1. 5mm、蒸煮时间 30min 条件下, 可发酵性物质的损失可达 2.6%。生料工艺与熟料工艺相比, 可将淀粉不彻底糊化的损失降到等于或低于熟料工艺的可发酵性物质损失量。在生料酿造中所用的酶制剂有糖化酶和根霉淀粉酶等。黑曲糖化酶系除具有高活性的淀粉酶系外，还有相当活力的纤维素酶和果胶酶系, 这种较全面的酶系为生料工艺奠定了良好的基础。此外, 根霉淀粉酶系中含有比黑曲糖化酶生淀粉分解能力强 3 倍的淀粉酶系, 两种酶系配合使用, 可大幅度提高淀粉利用率, 提高出酒率5。随着当前经济的不断发展，我国酒类市场有不断扩大的趋势，人们对各
9、种食用酒精、蒸馏酒、发酵酒的数量和质量的要求都有很大的提高，从而推动了酿酒行业的不断发展，同时由于节能和环保的需求，酿酒的生产方法也有了很大的进步，除了传统的高温蒸煮发酵酿酒技术，生料免蒸煮酿酒技术应运而生。生料酿酒工艺与传统酿酒工艺比较，具有节约能源，提高出酒率，操作简便，便于工业化生产等优点，被誉为我国酿酒工业发展的方向 6。由于生料酿酒工艺具有节约能源、提高出酒率、操作简便、便于工业化生产等优点，其在酒精、白酒、黄酒生产中的应用日益广泛。在酒精生产方面，1981 年，eiuosuke Ued2等人报道了用木薯制酒精的试验方法 ,将 Asp.awamori NRRL-3l12 和 Asp.
10、 niger 菌种在麸皮上于 30 培养 3 d 制成淀粉酶，将粉碎的木薯浆和淀粉酶、酵母混合，在 pH 3.5、30 下发酵 5 d，生木薯的酒精产量是理论值的 82 %99 %。1983 年,四川省食品工业研究所进行了生料发酵制酒精的工业化生产性试验，并取得了丰硕成果 3。Nobuya Matsumoto4等阐述了以谷物为原料的无蒸煮酒精发酵的工业化问题，其发酵效率等于或高于高温和低温蒸煮法。在以玉米等的谷物为原料进行酒精的工业化生产中，采用无蒸煮法可以节省大量能源。秦先魁 5论述了用低脂玉米粉无蒸煮液态发酵新工艺制取酒精的工艺流程、操作及主要技术参数，提出用低脂玉米粉生产酒精其综合效益高
11、于薯类原料及玉米整粒。白酒是世界上六大蒸馏酒之一，是我国的国酒。目前，白酒行业年产 3 万 t 以上的企业有 17 家，白酒集团公司约 20 家，白酒行业年利税亿元以上的有 20 余家，白酒全国年产量为 500600 万 t。1999 年，四川省食品发酵工业研究设计院刘义刚先生发表了“无蒸煮原料液态法酿酒技术初探”一文，对生料酿酒工艺技术作了研究，并做了酿酒生产试验，取玉米粉 50 kg，加清水 125 kg，生料酒曲 300 g，控制品温 桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告42835 ，发酵 7 d 蒸馏产酒 30.5 kg（酒精含量以 60 计） ，出酒率达 61 %。
12、2000 年，黑龙江哈尔滨市三丰酿酒发酵研究所孙有波 6等对生料液态白酒生产技术做了研究，认为液态生料制酒，所产白酒的总酸、总酯及杂醇油含量与固态酶法酒相近，采用多功能生香酒曲可提高和改善酒质，同时延长发酵期，使白酒酯香和醇香更协调，酒体更丰满，同时口感更绵柔、杂味减少、香味突出。在黄酒生产方面，岳春 7等的“生料法在玉米黄酒中的应用”论述了生料液态法酿造玉米黄酒的全过程，糖化发酵时，加水量为 250 %，曲霉的加入量为 10 %，根霉曲加入量为 10 %，黄酒活性干酵母的加入量为 0.4%，陈酿时采用高低温间隔法，既提高了原料利用率，又缩短了黄酒酿造时间。2004 年，侯振建 8等对生料法酿
13、造黄酒的工艺条件进行了初步研究。以糯米为原料，无蒸煮技术采用淀粉糖化和酒精发酵同时进行，接入 3 %的麦曲和 0.6%的生料曲，于 26 左右发酵，可制得醇香浓郁的黄酒。本实验主要进行了发酵前期、发酵中期、发酵后期三个发酵期，为期 8 天，通过发酵期间糖度、酒精度、酸度等的检测来观察发酵情况。发酵期间检测：发酵前期，进行一次染菌情况检查；发酵中期，每天一次酒精度、总酸度及糖度的检测；发酵后期，每两个小时检测一次酒精度、总酸度及糖度。桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告51 实验原理1.1 生料酿酒原理生料酿酒是一种新兴的白酒酿造技术，使用的原料是大米、玉米等。相比熟料，生料酿
14、酒酒曲使用糖化能力较强的酶直接作用于淀粉颗粒的外膜，使淀粉分解，生成糊精，再转化成麦芽糖，最终得到可发酵性葡萄糖。可发酵性葡萄糖在经过一系列和熟料相似的程序，生成酒精等，然后分离、纯化，就得到了白酒。1.2 总酸度测定原理6食品中的有机弱酸可用标准强碱(如 NaOH)测定。用酚酞作指示剂。当滴定至终点(pH=82 指示剂显红色，根据滴定所消耗的标准 NaOH 的体积，可计算出样品中总酸含量。1.3 总酯测定原理7用碱中和样品中的游离酸，再准确加入一定量的碱，加热回流使酯类皂化。通过消耗碱的量计算出总酯的含量。先用 NaOH 中和酒样中的酸性物质，然后加入过量且定量的 NaOH 标准溶液使之与酒
15、样中的酯类起皂化反应：CH3C00C2H5+Na0HCH 3COONa+C2H5OH剩余的碱再用硫酸标准溶液滴定至终点，根据皂化反应所消耗碱量计算酯类总量。1.4 甲醇测定原理8甲醇的测定方法有气相色谱法和比色法等。气相色谱法简单、快速、准确，已订为国家标准(GB7917.4 一 87)，但国内目前实验室条件不同，没有气相色谱仪的实验室，可用化学法测定甲醇含量。此方法对仪器设备要求简单，方法精度可以满足化妆品卫生标准要求。含乙醇的化妆品中的甲醇在蒸馏时，乙醇、甲醇一起被蒸出。蒸出物中的甲醇在酸性条件下被高锰酸钾氧化成甲醛，甲醛在浓硫酸中与变色酸共热，生成紫红色水溶性化合物，于波长 580nm
16、处比色定量。桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告62 实验部分2.1 材料、试剂与仪器2.1.2 实验原料1糖化酶 北京奥博星生物技术有限公司。2活性酵母 广州丹宝利公司3生香酵母 湖北安琪酵母股份有限公司产。4大米 要求颗粒饱满，无霉变，无杂质，大米淀粉含量69%5细菌培养基、酵母培养基2.1.3 主要试剂细菌培养基：牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 1520g、水1000ml，pH7.47.6 。酵母培养基：马铃薯 200g、琼脂 1520g，自然 pH 加水至 1000ml。高锰酸钾磷酸溶液：称取 3 克 KMnO4，加入 15 毫升 H3PO4(85
17、%)与 70 毫升水的混合物中，溶解后加水至 100 毫升，贮于棕色瓶内，为防止氧化能力降低，保存时间不宜过长.草酸硫酸溶液：称取 5 克 H2C2O4 或 7 克 H2C2O42H2O，溶于 H2SO4(1:1)中至100 毫升品红亚硫酸溶液：称取 0.1 克碱性品红研细后，分批加入共 60 毫升 80的水，边加入水边研磨使其溶解，用滴管吸取上层溶液过滤于 100 毫升容量瓶中，冷却后加人 10 毫升 10%Na2SO3 溶液，1 毫升浓 HCI，再加水至刻度，充分混匀，放置过夜，如溶液有颜色，可加少量活性炭搅拌后过滤，贮于棕色瓶中，置暗处保存，溶液呈红色时，应弃去重新配制。（0.1mol/
18、L ）NaOH 溶液（0.05mol/L） 硫酸溶液2.1.4 主要仪器500ml 三角瓶 2 个、糖度仪、100ml 三角瓶一个、100ml 量筒、滴定管、酒精度仪、水浴锅、旋转蒸发仪、烧杯、滴管、滤纸、容量瓶若干、粉碎机等桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告72.2 实验方法2.2.1 大米生料酿酒工艺9大米生料酿酒基本工艺路线如下所示：原料 粉碎 水生料酒曲糖化酶活性干酵母生香酵母搅拌封口发酵蒸馏成品取粉碎后的大米（40 目以上）100g，两份，再取 500mL 三角烧瓶两个 ，各加300mL 水，然后将称好的大米加入其中，充分搅拌，用 1的柠檬酸调 pH 值 4.0-
19、5.0，温度控制在 2630。按粮、酶比例加入 0.3%的糖化酶，同时加入 0.2%的活性干酵母和 0.1生香酵母，搅拌均匀，做到不成团，不起疙瘩即可，封闭进行发酵，发酵温度30，发酵期控制为 8 天。发酵前期每天搅拌一次，使发酵瓶底部的原料与糖化、发酵剂充分接触，均匀彻底发酵，使所有淀粉能充分利用。发酵中期，搅拌醪液时一定要注意封闭隔氧。搅棒要清洗干净，以免发酵醪液染菌，升酸较快、较大，影响出酒率。发酵后期，不宜频繁搅拌，以减少酒精分的挥发损失。发酵完毕，采用旋转蒸发仪，将酒蒸出，酒精度在 4050之间；掐去酒头（前45mL） ，取酒，去尾（30以下的酒） 。2.2.2 大米生料酿酒过程监控
20、发酵前期，进行一次染菌情况检查；发酵中期，每天一次酒精度、总酸度及糖度的检测；发酵后期，每两个小时检测一次酒精度、总酸度及糖度。发酵液的成熟检查：眼看液面料糟是否都沉入瓶底，醪液由浑浊变清，发酵终止醪液呈淡茶色，整个发酵醪液呈静止状态，无气泡现象；闻有舒畅的香味和冲鼻的香味逸出；口尝微酸不甜。成熟度理化检测指标见表 2-1。表 2-1 理化检测指标检测项目 酒精度(%) 还原糖 总酸指标 912 0.35 0.50成品检验：感官无色透明，无沉淀，无悬浮物；香气具有本产品固有的香气；口味味醇和，净爽，无邪杂味； 总酯、总酸和甲醇含量测定。2.2.3 检测方法2.2.3.1 总酸度的测定10NaO
21、H 的标定：精确称取 0.6 克的基准物邻苯二甲酸氢钾，于 250mL 锥形瓶中，加 50mL 蒸馏水溶解，加酚酞 2 滴作指示剂，用配置的 NaOH 标准溶液滴定至显淡红桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告8色，30 秒不退色，同时做空白实验，利用公式计算出氢氧化钠标准溶液浓度： 2.04)(12VMCC氢氧化钠标准溶液浓度；M基准物邻苯二甲酸氢钾的质量；V 1-滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积；V 2空白试验所消耗氢氧化钠标准溶液体积。总酸度的测定：对于酒类物质，混匀样品直接取样准确吸取已制备的滤液 15mL于 250mL 锥形瓶中滴加 2 滴酚酞作指示剂，用 0.1m
22、olL 氢氧化钠标准溶液滴定至溶液显淡红色，30 秒不褪色，记录消耗 0.1molL 氢氧化钠标准溶液的量，利用下公式计算总酸度。 %10VMKCX其中：X总酸度；C氢氧化钠标准溶液浓度， mol/L；V 消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；M样品的体积，mL；V 0样品稀释液总体积；V 1滴定时吸取样品液的体积；K=0.06。2.2.3.2 总酯的测定取酒样 12.5mL(V3)，注入 250m1 具塞锥形瓶中，加 2-3 滴酚酞作指示剂，用0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至溶液微红，30 秒不褪色准确加入 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液 12.5mL 摇匀，加塞在水浴上回流 30 分
23、钟，用 0.05mol/L 硫酸标准溶液(用标定后的 0.1mol/L 的 NaOH 标定)滴定至溶液红色刚褪。按下式计算总酯含量：总酯(g/L 以乙酸乙酯计 )= 3421 08.)5.(0VC式中：C 1氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；C 2硫酸标准溶液的浓度，mol/L；V 3酒样的体积，mL；V 4滴定消耗硫酸标准溶液的体积，mL。2.2.3.3 甲醇的测定（1）甲醇标准曲线的制备吸取 0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL 甲醇标准使用液(相当于0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg 甲醇)分别置于 25mL 具塞比色管中，并加入 0.5m1 60不
24、含甲醇的乙醇溶液。各加水至 5mL，再依次各加 2mL 高锰酸钾磷酸溶液，混匀，放置 10min，各加 2mL 草酸硫酸溶液，混匀使之褪色，再各加 5mL 品红亚硫酸溶液，混匀，于 20以上静置 0.5h，用 2cm 比色皿，以零管调节零点，于波长 590nm 处桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告9测吸光度，绘制标准曲线。（2）样品甲醇含量的测定根据样品中乙醇浓度适当取样(乙醇浓度 30%取 1.0mL，40取 0.8mL，50取0.6mL， 60取 0.5mL)，置于 25mL 具塞比色管中。加水至 5mL 按标准曲线再依次加2mL 高锰酸钾磷酸方法，测波长 590nm
25、处吸光度值。按下式计算样品甲醇浓度：甲醇(g100mL)= 105VC式中：C测定样品中甲醇的含量，mg；V 5样品体积，mL桂林理工大学生化生学院物工程专业 11 级技能实习报告103 结果与讨论3.1 发酵期间各指标检测3.1.1 糖度发酵期间的糖度检测结果如表 3-1 所示：表 3-1-1 糖度检测数据表测底日期 总糖度2014/5/30 72014/5/31 62014/6/1 6662014/6/252014/6/3 4介于操作人员的不同等条件，所测数据存在些许问题。但从大体上，发酵过程的总糖度是成下降状态，符合实验要求。3.1.2酸度发酵期间发酵液的酸度检测结果如图 3-2 所示：表 3-1-2 酸度检测数据表酸度测定测底日期NaOH 用量 酸度值2014/5/30 8.7ml 0.35%2014/5/31 7ml 0.28%2014/6/1 5.6ml 0.23%6.3ml 0.25%7.6ml 0.31%2014/6/28ml 0.32%2014/6/3 8.4ml 0.34%介于操作人员的不同等条件，所测数据存在些许问题。由此显示出的数据不尽人意，可以看出本组实验员在操作等的方面仍有待提高。
