1、2015年版中国药典微生物限度检查法计数法修订解析,一、修订背景,1、国际化（1）美国、欧盟、日本制药产品占世界市场份额的70-80%；ICHQ4B(药品管理部门对药典的互认)附录4A、4B和4C已经得出结论，美国药典、欧盟药典、日本药典中的微生物限度检验方法协调统一。（2）中国虽然不是ICH的成员国，但中国与国外制药行业交往日益增多，且中国药品要想进入国际市场，药品检验方法和标准的统一势在必行。,一、修订背景,2、方法科学性和灵活性（1）准确度：方法适用性试验模拟样品污染微生物后进行方法试验性验证。（2）精密度：结果判定以变化范围进行规定，符合微生物计数规律。（3）培养体系：采用更适宜的培养
2、体系。（4）偏差调查：微生物检验结果偏差调查的引入。（5）与微生物指导原则、理念有机统一。,一、修订背景,3、兼顾国情：（1）适用性试验增加供试品对照组（2）菌种采用CMCC（3）检验量、样品制备依照中国药典2010年版，与ICH不同。主要工艺、剂型限制，例如贴剂检验量规定完全不同。,一、修订背景,4、依据以上原则修订后具有以下特点：（1）修订后的计数法明确了中国药典2010年版未规定的事项。如：该检查方法的适用范围，替代法的应用原则。（2）修订后的计数法合理性、有效性、准确性得以充分体现，结果更接近真实污染状况。如：方法适用性加菌方式发生变化。（3）修订后的计数法与美国、欧洲、日本药典协调后
3、方法一致，对于采用国际、国内两套体系（检验方法和检验标准）的生产企业而言，在方法一致的前提下，检测结果具有可比性，减轻企业检验负担。,二、格式变化,一个部分微生物限度检查法三个部分1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法3、药品微生物限度标准：标准部分合并一部和二部内容,修订前,修订后,三、通用要求,1、检测环境（1）环境洁净度应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级单向流空气区域内进行。（2）现状：2010年版GMP环境分级以A、B、C、D定义，对于微生物检测环境无具体描述，与国家标准分级不一致；相应的监测方法有区别。制药企业难以制定对应的标准和检测方法。
4、（3）国际协调案要求：在适宜的洁净度的环境中进行。（4）发展趋势：既要最大可能防止微生物污染，又要防止检验过程对环境和人员造成的危害。活动区域的合理规划及区分将提高微生物实验室操作的可靠性。,三、通用要求,1、检测环境（5）USP实验室分区原则： 1）实验区域划分合理：无菌、非无菌样品操作区域应与活菌培养区完全隔离，或采取其他无菌操作及防护措施减少污染事件发生概率。所有在实验室操作的关键检测过程在控制条件下执行。 2）无菌检查的较适宜环境：隔离器的使用。,三、通用要求,2、供试品前处理,供试品,需前处理,不需前处理,有抑菌作用,无抑菌作用,去除抑菌作用,检查,方法适用性试验前处理方法对污染菌生
5、长、检出的影响。,中和剂灭活剂,可以通过方法适用性试验判断,验证抑菌活性去除的有效性，以及方法对污染菌生长、检出的影响,三、通用要求,3、微生物计数法适用范围,（1）微生物计数法适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。（2）明确规定本法不适用于活菌制剂的检查。（3）明确规定本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测方法，但必须 证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。,三、通用要求,4、微生物计数定义变化,三、通用要求,5、计数方法（1）平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可使用直径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。（2）薄膜过滤法（3）最大可能数（Most-Probable-Num
6、ber Method,简称MPN）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法时使用，不适用于霉菌计数。（4）方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。,三、通用要求,6、菌种（1）原则 不同来源菌种在实际使用时应依据中国药典2010年版附录 G药品微生物实验室规范指导原则的要求，药品微生物检验用试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,三、通用要求,（2）菌种编号CMCC中国医学菌种保藏中心 CMCC(F) 或 CMCC(B) B代表细菌 F代表真菌ATCC美国标准菌种收藏中心 著名的
7、微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等16000株以上的微生物种株。,三、通用要求,（3）传代： 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。 代的定义：每接种一次即为一代（有在新鲜的培养基上生长过程）,CV1,CV2,CV3,QC,干燥菌种（0代）,液体培养基复苏（1代）,三、通用要求,（4）菌种的保藏1）冷冻：在低温下保藏，需要加入保护剂，例如甘油，可以减少冷冻对菌种的伤害，一般在低于-30或-70 冰箱内保藏，是一种有效的长期储藏方法。2）冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法，
8、一般情况下购买的冻干菌种即为此种方法。使用时需要进行溶解、复壮、冷藏。3）冷藏：在28 的冰箱保藏，是一种短期的有效的短期储藏方法。储藏方法符合药典要求。,三、通用要求,（5）菌种及菌液的制备 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。注意事项：1）使用前确认菌种身份2）根据生产商说明书复苏菌种3）使用接种技术，不要重复从菌种包装瓶中移取菌种或重新冷冻菌种。4）传代代数（每接种一次即为一代）5）菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28 ，可在24小时内使用。,三、通用要求,7、试验菌,大肠埃希菌,铜绿假单胞菌,三、通用要求,8、培养基,三、通用要
9、求,9、培养条件嗜热型微生物最适生长温度为4558 嗜温型为2543 嗜冷型为1018 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌最适生长温度为37 ，白色念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28 ，均为嗜温型微生物。,四、培养基适用性检查,四、培养基适用性检查,四、培养基适用性检查,四、培养基适用性检查,四、培养基适用性检查,五、计数方法适用性试验,1、供试品,五、计数方法适用性试验,2、稀释液,五、计数方法适用性试验,3.试验菌,五、计数方法适用性试验,4、方法,五、计数方法适用性试验,常见的中和剂或灭活方法,五、计数方法适用性试验,无抑菌性样品方法适用性-例：多潘立酮片1、方法适用性试验前评估（
10、1）根据处方进行分析，产品中是否有抑菌成分；（2）参照历史上曾经进行过的方法验证，根据历史数据判断产品是否有抑菌性；（3）也可以通过预实验判断样品中是否有无抑菌性。通过以上判断，起草方法适用性试验草案，确定方法适用性试验具体过程。,五、计数方法适用性试验,无抑菌性样品方法适用性-例：多潘立酮片2、通过以上评估，判断多潘立酮片无抑菌性，可以采用规定的稀释液制备方法，采用平皿（直径90mm）法进行方法适用性试验，具体如下：（1）样品制备：称取供试品10g，加至TSB中，制成1:10的供试液；（2）试验组：西区1：10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液后摇匀；（3）菌液对照组
11、：西区胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的试验菌悬液后摇匀；,五、计数方法适用性试验,无抑菌性样品方法适用性-例：多潘立酮片（4）试验组和菌液对照组摇匀后，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每种试验菌平行2份。（5）供试品对照组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行4皿，其中两个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另两个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。（6）将以上平皿分别3035或2025培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。,五、计数方法适用性试验,无抑菌性样品
12、方法适用性-例：多潘立酮片（7）结果计算：判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.52范围内。如果是，则方法适用性试验结果满足要求。（8）建议：生产企业根据以上方法第二人及第三人进行确认。如果均满足要求，则该方法适用性试验通过，可以用于日常检验。,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（1）需氧菌总数：,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：曲安奈德益康唑乳膏1、方法适用性试验评估：（1）处方及历史数据分析：益康唑对霉菌、酵母和部分阳性杆菌均具有抑菌性。（2）根据历史数据分析，曲安奈德益康唑
13、乳膏对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、霉菌均有一定的抑菌性，需要进行稀释，加入中和剂对抑菌性中和后进行方法适用性试验。（3）微生物限度标准：需氧菌总数不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌总数不大于101cfu/g。注意：如果采用稀释法，需氧菌总数的稀释度不大于1:100，霉菌和酵母菌总数的稀释度不大于1:10，否则有一个菌落生长，样品则不能满足限度质量标准要求。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：曲安奈德益康唑乳膏2、根据以上判断，初步设定的方法适用性试验如下：（1）样品制备：称取供试品10g加入含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，制成1:10的供试品溶液；吸取1:10的供试液
14、20ml加入80ml含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，摇匀制成1:50供试液。（2）试验组： 吸取1:50的供试液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认需氧菌总数测定方法。 另吸取1:10的供试液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液后摇匀，确认霉菌和酵母菌总数的测定方法。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：曲安奈德益康唑乳膏（3）中和剂对照组：吸取含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（4）菌液对照组：吸取胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（5
15、）供试品对照组：吸取1:50的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行制备两份，加入TSA培养基；吸取1:10的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行制备2份，加入SDA培养基，摇匀。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：曲安奈德益康唑乳膏（6）试验组、中和剂对照组和菌液对照组摇匀后，分别从TAMC试验菌试管中吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入TSA培养基；另从真菌试管中分别吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入SDA培养基。（7）将以上平皿放入3035或2025培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。（8）结
16、果计算： 判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.52范围内。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：曲安奈德益康唑乳膏 中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.52范围内。 如果以上均满足要求，则适用性试验结果满足要求。（9）建议：生产企业根据以上方法第二人及第三人进行确认。如果均满足要求，则该方法验证成功，可以用以日常检验。,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（1）需氧菌总数：,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂1、方法适用性试验评估：（1）
17、处方集历史数据分析：该产品为抗真菌药，对白色念珠菌具有抑菌性或杀菌性。（2）根据历史数据分析，酮康唑洗剂对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌有一定的抑菌性，需要进行稀释，加入中和剂对抑菌性中和后进行方法适用性试验。（3）微生物限度标准为需氧菌总数不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌总数不大于101cfu/g。注意：如果采用稀释法，需氧菌总数的稀释度不大于1:100，霉菌和酵母菌总数的稀释度不大于1:10，否则有一个菌落生长，样品则不能满足限度质量标准要求。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂2、根据以上判断，初步设定的方法适用性试验如下：（1）样品制备：称取供试品10g加入含
18、有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，制成1:10的供试液；吸取1:10的供试液20ml加入80ml含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤中，摇匀制成1:50供试液。（2）试验组： 吸取1:50的供试液9.9ml，共10份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认需氧菌总数测定方法。 另吸取1:10的供试液9.9ml，共4份，每份中加入0.1ml的要求试验菌悬液后摇匀，确认霉菌和酵母菌总数测定方法。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂（3）中和剂对照组：吸取含有中和剂聚山梨酯80的胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（4）菌液对照
19、组：吸取胰酪大豆胨肉汤9.9ml，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。（5）试验组、中和剂对照组和菌液对照组摇匀后，分别从所有细菌试验菌试管中吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取10ml加入直径14cm的3个平皿中，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基。每种试验菌平行制备2份。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂（6）供试品对照组：吸取1:50的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行2份，加入胰酪大豆胨琼脂培养基；吸取1:10的供试液10ml加入直径14cm的3个平皿中，平行2份，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。（
20、7）将以上胰酪大豆琼脂平皿放入3035，沙氏葡萄糖琼脂平皿放入2025进行培养，细菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。（8）结果计算： 判断试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组的比值是否在0.52范围内。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂 中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.52范围内。 如果以上均满足要求，则适用性试验结果满足要求。,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（1）需氧菌总数：,五、计数方法适用性试验,3、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮
21、康唑洗剂4、小结：用中和剂以及稀释法均不能使白色念珠菌和枯草芽孢杆菌恢复，进一步用薄膜过滤法进行方法适用性试验的优化：（1）用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜；（2）取1:10的供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤。（3）用含5%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂（2）中和剂对照组 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。 取10
22、ml含聚山梨酯80的TSB加入预湿后的滤膜中，立即过滤。 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂（3）菌液对照组 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，在第二次冲洗液中加入50cfu试验菌，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。,五、计数方法适用性试验,
23、抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂（4）供试品对照组 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。 取1:10供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤。 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，滤干后将滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂平板上。备注：培养温度及培养时间同平皿法，每一种试验用菌用一个滤膜。,五、计数方法适用性试验,5、试验结果-（1）需氧菌总数：,五、计数方法适用性试验,5、试验结果-（2）霉菌和酵母菌总数：,五、计数方法适用性试验,抑菌性样品方法适用性-例：酮康唑洗剂根据以上的方法适用性试验，
24、最终的检验方法如下：(6)检查方法：薄膜过滤法 供试液制备：称取供试品10g加入含有中和剂聚山梨酯80的TSB。 用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml预湿滤膜。 取1:10的供试液10ml加入预湿后的滤膜中，立即过滤，用含5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗200ml，100ml/次，贴于胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。 将以上胰酪大豆琼脂平皿放入3035培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平皿放入2025培养5-7天。,五、计数方法适用性试验,5、MPN MPN法的最可能数法的精确性不及平皿法和薄膜过滤法，不适宜霉菌计数。因此该法仅在没有其他方
25、法可供选择的情况下，作为需氧菌总数计数法。 例如：食品国标中大肠菌群的MPN计数法（第一法），其优点在于少量菌在经过増菌后进行直接观察结果，通过查表得到计数结果。,五、计数方法适用性试验,6、小结（1）抗菌活性的去除 增加稀释剂和培养基的用量； 加入中和剂或灭火剂； 采用薄膜过滤法和冲洗； 综合上述措施 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么方法适用性试验中微生物祸首的失败可看做因为供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能（是否改成极难合适）被微生物污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影
26、响检验结果判断的前提下，应采用能是微生物生长的更高稀释级的公事业进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。,五、计数方法适用性试验,（2）影响因素 试验菌：革兰阴性菌、格兰阳性菌、霉菌和酵母菌； 菌液的制备：菌液制备及储存应当标准化，满足使用的菌液（群体）均一性，活性一致性； 采特定的试验条件：包括缓冲液、温度、水、光照应当标准化且经过验证； 回收测定的关键因素：培养基的质量、培养条件方法适用性条件与样品检测条件需一致。,六、供试品检查,1、检验量,六、供试品检查,2、阴性对照,六、供试品检查,3、计数,六、供试品检查,4、培养,七、
27、结果判定,1、计数要求,七、结果判定,2、计数干扰,七、结果判定,3、计数结果,七、结果判定,4、技术标准（修订后增加内容）各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下：101cfu 可接受的最大限度为20； 102cfu 可接受的最大限度为200； 103cfu 可接受的最大限度为2000；依此类推 若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的见擦结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。例如：档标准为101cfu，不同于以往10cfu规定以10的指数规定标准，考虑了微生物计数结果的可变性，即计数结果的精密度，而非类似化学检验的结果。故
28、要求我们需要在结果判断时或制定内控标准时，对于结果的判断或历史数据，工艺过程、用药人群等进行相应分析，制定合理的内控标准，即总原则为在内控标准的控制下产品无任何质量风险。,七、结果判定,4、计数标准（标准理解）（1）该理论可参见中国药典附录及美国药典结果精密度分析，从该部分内容可以看出微生物计数结果的精密度与菌数的多少有直接关系，污染量偏小或偏大均有可能造成结果的误差较大。同样该部分内容可以解释培养基适用性检查和方法适用性检查的可接受限50200%的含义。（2）当平板上活细胞数量增加，聚集效应导致计数准确性降低，较低评估了菌落数量。当平板活细胞数量减少，随机误差导致较高评估菌落数量。（3）细菌
29、和包色念珠菌落计数范围为25250。此范围对于药典的微生物（特别是真菌）时可接受的。对于黑曲霉，每个平板最理想的计数方位是880之间。,八、增加新概念,1、MPN法适用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定。可作为平板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充。2、供试液制备中增加“分散均匀”概念，并非一定要溶解。3、表面活性剂使用时，在确认对微生物无毒害性的同时，需要确认与使用的中和剂或表面活性剂的相容性。4、偏差调查概念引入。,八、增加新概念,偏差调查（1）当检验结果出现超常或超标时均需要进行偏差调查。（2）调查范围人、机、料、法、环。（3）偏差调查的范围至少包括： 微生物鉴别-初步确定污染源。 原始数据以及阴阳性对照回顾。 培养基及所用的其他耗材是否满足质量标准要求。 取样环境是否满足要求。 同期进行检验的其他结果是否正常。 消毒剂是否在有效期内，且消毒是否正确。 必要情况下进行相应的复试。,Thank You,
