人磷酸化AKT蛋白AKTELISA试剂盒.DOC

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1、上海西唐生物科技有限公司 电话 :021-55229872 55229873 技术咨询 : 人 磷酸化 AKT 蛋白 (AKT)ELISA 试剂盒 (用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内 ) 原理 本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗 人 AKT 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 AKT与单抗结合,加入生物素化的抗 人 AKT,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在 450nm 处测 OD 值, AKT 浓度与 OD 值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中 AKT 浓度。 试剂盒

2、组成 ( 2-8 保存) 酶标 板 ( Coated Wells) 96孔 酶标抗体工作液 ( Enzyme Conjugate) 12ml 10 标本稀释液 ( Sample Buffer) 12ml 20浓缩洗涤液( Wash Buffer) 50ml 标准品 ( Standards) : 200uM/瓶 2瓶 底物工作液( TMB Solution) 12ml 第一抗体工作 液 ( Biotinylated Antibody) 12ml 终止液 ( Stop Solution) 12ml 准备试剂与收集血样 1. 收集标本:血清、血浆( EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养 上清液、

3、组织匀浆等尽早检测, 2-8 保存 48 小时 ;更长时间须冷冻( -20 或 -70 )保存,避免反复冻融。 2. 标准品液配制:使用前加入 1ml 蒸馏水 混匀,配成 200uM/L 的溶液 。 设标准 管 8 管,第一管加标本稀释液 900ul,第二至第八管加入标本稀释液 500ul。在第一管中加入 200uM/L 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul,移至第二 管 。如此反复作对倍稀释,从第七 管 中吸出 500ul弃去。第八 管 为空白对照。 3. 10 标本稀释液用蒸馏水作 1:10 倍稀释( 示例: 1ml 浓稀释液 +9ml 蒸馏水)。 4. 洗涤液:用重蒸

4、水 1:20 稀释(示例: 1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水) 检测程序 1. 加样:每孔各加入标准品或待测样品 100ul,将反应板充分混匀后置 37 120 分钟。 2. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次,向滤纸上印干。 3. 每孔中加入第一抗体工作液 100ul。将反应板充分混匀后置 37 60 分钟。 4. 洗板:同前。 5. 每孔加酶标抗体工作液 100ul。将反应板置 37 30 分钟。 6. 洗板:同前。 7. 每孔加入底物工作液 100ul,置 37 暗处反应 15 分钟。 8. 每孔加入 100ul 终止液混匀。 9. 30 分钟内用酶标仪在 450nm

5、处 测 吸光值。 结果计算与判断 1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。 2. 以标准品 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312、 0 uM/L 为横坐标, OD 值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。 3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 AKT 含量。 试剂盒性能 1. 灵敏度 : 最小的 AKT 检测浓度小于 0.2uM/L。 2. 特异性: 可同时检测重组或天然的 人 AKT。 不与 人 其它细胞因子有交叉反应。 3. 重复性:板内、板见变异系数均小于 10.3。 注意事项 1. 以上标准孔及待 测 样品均建议做复孔,每次测定应同时 做 标准曲线。 2. 洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。 3. 板条开封后剩余板条要再封好,保持 板条干燥 。 4. 本试剂盒宜置 4oC 冰箱保存。 5. 本试剂盒 仅用于科研,不能用于临床诊断!

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