1、上海西唐生物科技有限公司 电话 :021-55229872 55229873 技术咨询 : 人 热休克蛋白 60(HSP60)ELISA 试剂盒 原理 本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA 法。用抗 人 HSP60 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 HSP60 与单抗结合，加入生物素化的抗 人 HSP60，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值， HSP60浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中 HSP60 浓度。 试剂盒组成 （ 2-8 保存） 酶标 板
2、 （ Coated Wells） 96孔 酶标抗 体工作液 （ Enzyme Conjugate） 12ml 10 标本稀释液 （ Sample Buffer） 12ml 20浓缩洗涤液（ Wash Buffer） 50ml 标准品 （ Standards） ： 8ng/瓶 2瓶 底物工作液（ TMB Solution） 12ml 第一抗体工作 液 （ Biotinylated Antibody） 12ml 终止液 （ Stop Solution） 12ml 准备试剂与收集血样 1. 收集标本：血清、血浆（ EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等 裂解产物 尽早检测， 2-8 保存48 小时
3、；更长时间须冷冻（ -20 或 -70 ）保存，避免反复冻融。 2. 标准品液配制：使用前加入 0.5ml 蒸馏水 混匀，配成 16000pg/ml 的溶液 。 设标准 管 8 管， 每 管加入标本稀释液 200ul。在第一管中加入 16000pg/ml 的标准品溶液 200ul 混匀后用加样器吸出200ul，移至第二 管 。如此反复作对倍稀释，从第七 管 中吸出 200ul 弃去。第八 管 为空白对照。 3. 10 标本稀释液用蒸馏水作 1:10 倍稀释（ 示例： 1ml 浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。 4. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例： 1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸
4、水） 标本激活方法 1. 将 450ul 标本稀释液加入到一支 1.5ml 进口聚丙烯管中 ,再加 10ul 血清或血浆标本。 2. 加 20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。 2 8 放置 60 2 分钟。 3. 加 20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。 4. 即用，或放 -20/-70 保存 3 天。计算结果时乘 以稀释倍数 50。 （ 注意：不同的标本 HSP60 的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度） 5. 细胞培养上清或组织匀浆 10 倍稀释 (410ul 的标本稀释液 50ul 样本 20ul 的 1N HCI+20ul 的1N NaOH)。 检测程序 1
5、. 加样：每孔各加入标准品或待测样品 （已激活） 100ul，将反应板充分混匀后置 37 120 分钟。 2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。 3. 每孔中加入第一抗体工作液 100ul。将反应板充分混匀后置 37 60 分钟。 4. 洗板：同前。 5. 每孔加酶标抗体工作液 100ul。将反应板置 37 30 分钟。 6. 洗板：同前。 7. 每孔加入底物工作液 100ul，置 37 暗处反应 15 分钟。 8. 每孔 加入 100ul 终止液混匀。 9. 30 分钟内用酶标仪在 450nm 处测 吸光值。 结果计算与判断 1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行
6、计算。 2. 以标准品 8000、 4000、 2000、 1000、 500、 250、 125、 0 pg/ml 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。 3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 HSP60 含量 ，再乘上稀释倍数即可 。 试剂盒性能 1. 灵敏度 ： 最小的 HSP60 检测浓度小于 65pg/ml。 2. 特异性： 可同时检测重组或天然的 人 HSP60。 不与 人 其它细胞因子有交叉反应。 3. 重复性：板内、 板见变异系数均小于 12。 注意事项 1. 以上标准孔及待 测 样品均建议做复孔，每次测定应同时 做 标准曲线。 2. 洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。 3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持 板条干燥 。 4. 本试剂盒宜置 4oC 冰箱保存。 5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！
