1、人氧化型高密度脂蛋白酶联免疫分析 试剂盒使用 方法 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围: 96T 6.0mol/L -160mol/L 使用目的: 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)水平。用纯化的人氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL),再与 HRP 标记的氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)抗体 结合,形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色
2、。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值),通过标准曲线计算样品中人氧化型高密度脂蛋白( ox-HDL)浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 20ml 1 瓶 7 终止液 6ml 1 瓶 2 酶标试剂 6ml 1 瓶 8 标准品( 320 mol/L) 0.5ml 1 瓶 3 酶标包被板 12 孔 8 条 9 标准品稀释液 1.5ml 1 瓶 4 样品稀释液 6ml 1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml 1 瓶 1
3、1 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml 1/瓶 12 密封袋 1 个 标本要求 1标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于 -20保存,但应避免反复冻融 2不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP)活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照 下列图表在小试管中进行稀释。 160 mol/L 5 号标准品 150 l 的原倍标准品加入 150 l 标准品稀释液 80 mol/L 4 号标准品 150 l 的 5 号标准品加入 150 l 标准品稀释液 40 mol
4、/L 3 号标准品 150 l 的 4 号标准品加入 150 l 标准品稀释液 20 mol/L 2 号标准品 150 l 的 3 号标准品加入 150 l 标准品稀释液 10 mol/L 1 号标准品 150 l 的 2 号标准品加入 150 l 标准品稀释液 2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50 l,待测样品孔中先加样品稀释液 40 l,然后再加待测样品 10 l(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。 3. 温育:用封板膜封板后置 37温育 30
5、分钟。 4. 配液:将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。 6. 加酶:每 孔加入酶标试剂 50 l,空白孔除外。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。 9. 显色:每孔先加入显色剂 A50 l,再加入显色剂 B50 l,轻轻震荡混匀, 37避光显色 15 分钟 . 10. 终止:每孔加终止液 50 l,终止反应(此时蓝色立转黄色)。 11. 测定:以空白空调零, 450nm 波长依序测量各孔的吸光度( OD 值)。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 计
6、算 以标准物的浓度为横坐标, OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数; 或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 注意事项 1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。 2浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。 3各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4 请每次测定的同时做标准曲线,最 好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数( n 倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数( n 5)。 5 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 6底物请避光保存。 7严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1试剂盒保存:; 2-8。 2有效期: 6 个月