1、文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：1/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草 部门：QC 组 签名： 日期：部门：QC 组 签名： 日期：审核部门：质量部 签名： 日期：批准 质量负责人 签名： 日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。文件编号 修订原因 修订日期TS-VP-4201-00 按 GMP（2010 年修订版）要求新制定 2015.10.22文件类型：技术标准 生效日期：2015.1
2、0.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：2/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案目 录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1 试验菌株7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.4 需氧菌总数检查方法验证离心沉淀-薄膜过滤法7.5 控制菌检查方法验证离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审文件类型：技
3、术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：3/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照中国药典2015 版四部附录 1105：微生物计数法，以及 1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲
4、硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用 3 批按 GMP 要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。3.组织及职责3.
5、1 验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部 QC 组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由 QC 组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。3.2 验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后， ，由 QC 组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。3.3 验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。3.4 验证工作小组成员表姓名 部门及职务 职 责黄汉新 质量负责人/质量受权人 负责验证方案及报告的批准胡建新 质
6、量部 QA 组长 审核验证方案、审核验证报告并协调工作曾凤敏 质量部 QC 组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：4/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案刘红华 质量部 QC 负责验证方案起草、具体实施、报告工作4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是 2015 年 12 月至 2016 年 1 月。5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表序号仪器设备名称 型 号 编号 校准单位 校准日期 有效期至1
7、电子天平2 生化培养箱3 生化培养箱4 生化培养箱5立式压力蒸汽灭菌锅6 生物洁净安全柜检查人/日期： 复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表文件名称 文件编码 是否有效版本 文件保存处人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准 是 否 质量部人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程 是 否 质量部取样操作规程 是 否 质量部微生物限度检查操作规程 是 否 质量部微生物实验室清洁消毒操作规程 是 否 质量部培养基的管理制度 是 否 质量部检定菌的保存、传代、使用、销毁规程 是 否 质量部LDZX-30FBS 立式压力压蒸汽灭菌器操作规程 是 否 质量部SPX-150B 生化培养箱操作规程 是 否 质量部BHC-
8、1300IIA/B3 生物洁净安全柜操 是 否 质量部文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：5/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案作规程JJ200 电子天平操作规程 是 否 质量部检查人/日期： 复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表序 号 菌 种 名 称 代 码 冻 干 菌 种批 号 来 源1 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院2 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104 中 国 食 品 药 品 检 定 研
9、 究 院3 枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院4 白色念珠菌 CMCC（F）98001 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院5 黑曲霉 CMCC（F）98003 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院6 大肠埃希菌 CMCC（B）44102 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院7 乙型副伤寒沙门菌 CMCC（B）50094 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院检查人/日期： 复核人/日期：6.2 试验所需的培养基检查序号 名称 生产厂家 是否通过培养基适用性试验 批号01 胰酪大豆胨液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否0
10、2 胰酪大豆胨琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否03 沙氏葡萄糖液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否04 沙氏葡萄糖琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否05 麦康凯液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否06 麦康凯琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否07 RV 沙门菌增菌液体培养基 北京三药科技开发公司 是 否文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：6/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案08 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 北京三药科技开发公司 是 否09 三糖铁琼脂培养基 北京三
11、药科技开发公司 是 否检查人/日期： 复核人/日期：文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：7/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案6.3. 检验样品确认表序号 品名 生产厂家 批号 规格 是否按 GMP要求生产1人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是 否2人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是 否3人工牛黄甲硝唑胶囊佛山市华普生药业有限公司 甲硝唑 0.2g人工牛黄 5mg是 否检查人/日期： 复核人/日期：7.验证项目和
12、验证方法7.1 试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过 5 代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至 10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养 1824 小时，取此培养液 1ml 加 0.9无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10倍递增稀释法，稀释至 1
13、0-510 -7,制成 50100cfu/ml 的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml 沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养 23 天，取此培养液 1ml 加 0.9无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-510 -7，制成50100cfu/ml 的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2025培养 57 天，直到获得丰富的孢子。加入 35ml 含有 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取 1ml 加含有 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法
14、，稀释至 10-510 -7，制成 50100cfu/m 的孢子悬液备用。菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 28，可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28 ,在验证过的贮存期内使用。验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备 取供试品 10g，加 0.9%无菌氯化钠溶液至 100ml，振摇，制成 1：10 的供试液。文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：8/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限
15、度检查方法验证方案7.3.2.试验组取 1：10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 3035培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取 1：10 的供试液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 2025培养箱中培养 5 天
16、，点计菌落数。7.3.3.供试品对照组取 1：10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀，平行制备 2 个平皿。置 3035培养箱中培养 5 天，点计菌落数。另取 1：10 的供试液 1ml 注入平皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml 混匀，平行制备 2 个平皿。置 2025培养箱中培养 5 天，点计菌落数。7.3.4.菌液对照组取 0.9%无菌氯化钠溶液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2
17、个平皿。置3035培养箱中培养 3 天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养 5 天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。另取 0.9%无菌氯化钠溶液 1ml 和 7.2 项下制备的 50100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基 20ml 混匀，每株试验菌株平行制备 2 个平皿。置 2025培养箱中培养 5 天，点计菌落数。7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在 0 .52 范围内。7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果7.
18、3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数 1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率金黄色葡萄球菌文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：9/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期：
19、复核人/日期：试验次数 2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5 天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数 3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 3 天，白色念珠菌、黑曲霉 5
20、天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：7.3.6.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果文件类型：技术标准 生效日期：2015.10.22文件编码：TS-VP-4201-00 页数：10/21佛山市华普生药业 有限公司人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案试验次数 1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种
21、代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数 2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：试验次数 3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5 天试验组 供试品对照组 菌液对照组试验菌株菌种代数 1 2 均值 1 2 均值 1 2 均值试验菌的回收率白色念珠菌黑曲霉试验人/日期： 复核人/日期：7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在 0.52 范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。7.4. 需氧菌总数检查离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备
