1、干细胞的研究资料一.概述。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或 椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常 染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是自我复制还是分化功能细胞，主要由于细胞本身的状态和微环境因素所决定。包括调节细胞周期的各种周期素和周期素依赖激酶、基因转录因子、影响细胞不对称分裂的细胞质因子。微环境因素，包括干细胞与周围细胞，干细胞与外基质以及干细胞与
2、各种可溶性因子的相互作用。由于干细胞需要完成自我更新和分化的工作，它们必然举有一些独有的特征。比如说1. 干细胞本身不是终末分化细胞，也干细胞不是处于分化途径的终端，不像假复层纤毛上皮细胞这类细胞已经分无可分了。2. 干 细胞能无限增殖分裂；3. 干 细胞可 连续分裂几代，也可在 较长时间 内处于静止状态；4. 干细胞分裂产生的于细胞只能在两种途径中迭择其一或保持亲代特征，仍作为干细胞；或不可逆地向终末分化。由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数
3、的控制，可以说，干细胞是具多向潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞二.干细胞的分类。1.按照发育阶段分类胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell ）和成体干 细胞（Adult Stem Cell）。1、胚胎干细胞包括 ES 细胞（Embryonic Stem Cell）、EG 细胞（Embryonic Germ Cell）2、成体干细胞包括神经干细胞（Neural Stem Ce11，NSC）、血液干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓间充质干细胞（Mesen chymal Stem Cell，MSC）、表皮干细胞（EPidexmis Stem C
4、ell）等。按分化潜能，干细胞可分为，全能干细胞， 亚全能干细胞，多能干细胞，单能干细胞。全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能，如受精卵亚全能干细胞：为人类体内存在为数不多的三胚层分化潜能干细胞多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能。如胚胎干细胞（ES）单能干细胞：只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如神经干细胞、造血干细胞胚胎干细胞：ES 细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES 细 胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES 细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。胚胎干细
5、胞可来源于畸胎瘤细胞（EC）、桑椹球细胞（ES ）、囊胚内细胞团（ES ）、拟胚体细胞（ ES）、生殖原基细胞（ EG）等。当受精卵分裂发育成囊胚时，将内细胞团（Inner Cell Mass）分离出来进行培养，在一定条件下，这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性，因此被称为胚胎干细胞。胚胎干细胞在培养条件下，若加入白血病抑制因子 LIF（Leu kaemia Inhlbitory Factor），则能保持在未分化状态，若去掉 LIF，胚胎干细胞迅速分化，最终产生多种细胞系，如肌肉细胞、血细胞、神 经细胞或发育成“胚胎体 ”。成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造
6、血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞可以由下列几个方面得到：胚胎细胞由胚胎干细胞定向分化，或移植分化而成。胚胎组织由分离胚胎组织、细胞分离、或培养而成。成体组织由脐血、新生儿胎盘、骨髓、外周血、骨髓间质、脂肪 细胞等得到。造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干 细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干
7、细胞移植的长处在于无来源的限制，对 HLA 配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。神经干细胞：神经干细胞的研究尚处初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经细胞，可治愈部分患者的症状。周边血干细胞：骨髓中存有人体内最主要造血干细胞的来源,而周边血干细胞则是指借由施打白细胞生长激素(G-CSF),将骨髓中的干细胞驱动至血液中,再经由血液分离机收集取得之干细胞.由于与骨髓干细胞极为相近,现已逐渐取代需要全身麻醉的骨髓抽取手术.脂肪干细胞：以往人们因塑身而抽出的脂肪,大部分都当废弃物丢掉,现经由医学专家研究证,脂肪中
8、含有大量的间质干细胞,间质干细胞具有体外增生及多重分化的潜力,能运用于组织与器官的再生与修复.骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)：是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚层.MSC 最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注.如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神 经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复.骨髓间充质干细胞由于其来源广泛
9、,易于分离培养,并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点,越来越受到学者们的青睐,被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞.心脏干细胞以色列的科学家研究出了一种用干细胞做成的心脏，这是由干细胞的分裂形成的。胎盘造血干细胞胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，可以分化形成各种血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）的祖宗，注射到体内可以发挥造血功能。胎盘亚全能干细胞亚全能干细胞自胚胎形成的第 5 到
10、7 天开始出现，能分化形成 200多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。羊膜干细胞来源于羊膜上皮，表达多种胚胎干细胞的标志物，具有多系分化的能力，其分化能力超过骨髓来源的间充质干细胞，具有较低的免疫原性。胚胎干细胞（Embryonic Stem cell， ES 细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干 细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。早在
11、 1970 年 Martin Evans 已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。而人的胚胎干细胞的体外培养才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES 细胞）是一种高度未分化细胞。ES 细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC 细胞）的发现开始了 ES 细胞的生物学研究历程。许多研究工作都是以小鼠 ES 细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在成功的向试验鼠体内移植了由 ES 细胞培养出的神经胶质细胞。密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着 ES 细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES 细 胞的了解迈入了一个新的阶段。在 98 年末，两个
12、研究小组成功的培养出人类 ES 细胞，保持了 ES 细胞分化 为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类 ES 细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类 ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类 ES 细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类 ES 细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，因此要求展开人类 ES 细胞研究的呼声也一浪高似一浪。成体过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞，说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种
13、组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。造血造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中、胎盘组织中。 协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在 20 世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液系统疾病。到八十年代末，外周血干细胞移植（PBSCT）技术逐渐推广开来，绝大多数为自体外周血干细
14、胞移植（APBSCT），在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。在东北地区首例脐血干细胞移植成功，又为中国造血干细胞移植技术注入新的活力。随着脐血干细胞移植技术的不断完善，它可能会代替 APBSCT 的地位，为全世界更多的血液病及恶性肿瘤的患者带来福音。神经神经干细胞关于神经干细胞研究起步较晚，由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，如：给帕金森氏综合症患者的脑内
15、移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。实际上，到目前为止，人们对干细胞的了解仍存在许多盲区。2000 年年初美国研究人员无意中发现在胰腺中存有干细胞；加拿大研究人员在人、鼠、牛的视网膜中发现了始终处于“休眠状态的干细胞” ；有些科学家证实骨髓干细胞可发育成肝细胞，脑干细胞可发育成血细胞。随着干细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们对干细胞的了解也将更加全面。21 世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景。肌肉成肌细胞(myoblasts）可 发育
16、分化为成肌细胞 (myocytes），后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。骨髓骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。骨髓间充质干细胞具有如下的优点：一.具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。二.具有免疫调节功能，从而发挥免疫重建的功能。干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反
17、应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋人体胚胎干细胞人体胚胎干细胞白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。细胞内蛋白对干细胞分裂的调控：干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素 A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。转录因子的调
18、控 ：在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子 Oct4 是必需的。 Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是 FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠 ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是 Wnt 信号通路的中间
19、介质，当与 -Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。外源性调控除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。分泌因子 ：间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中成体干细胞在体内发育为不同组织成体干细胞在体内发育为不同组织都发挥重要作用，它们是 TGF 家族和 Wnt 信号通路。比如 TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表
20、现为干细胞数量的减少，而 GDNF 的过度表达导致未分化的精原细胞的累积3。 Wnts 的作用机制是通过阻止 -Catenin 分解从而激活 Tcf/Lef 介 导的转录，促 进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的 Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始和内胚层的分化。膜蛋白介导的细胞间的相互作用 ：有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。 -Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白 Notch 及其配体Delta 或 Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统
21、中，Notch 信号都起着非常重要的作用。当 Notch 与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当 Notch 活性被抑制时，干 细胞进入分化程序，发育为功能细胞4。整合素（Integrin）与细胞外基质：整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当 1 整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微 环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节 1 整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。干细胞的研究被认为开始于 1960 年代，在加拿大科学家恩尼斯特 莫科洛克和詹姆士堤尔的研究之后。体外培养的神经干细
22、胞体外培养的神经干细胞1959 年，美国首次报道了通过体外受精（F）动物。60 年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EG 细胞），此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells,EC 细胞）是一种干细胞。1968 年，Edwards 和 Bavister 在体外获得了第一个人卵子。70 年代，EC 细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的 SC 细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。1978 年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国 诞生。1981 年，Evan,Kaufm
23、an 和 Martin 从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES 细 胞。他们建立了小鼠 ES 细胞体外培养条件。由 这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将 ES 细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。19841988 年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤 细胞系 Tera-2 中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells,EC 细胞）。克隆的人 EC 细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。1989 年，Pera 等分离了一个人 EC 细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细
24、胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。1994 年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于 2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES 样细胞位于中央。1998 年美国有两个小组分别培养出了人的多能（pluripotent）干细胞：James A. Thomson 在 Wisconsin干细胞干细胞大学领导的研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass 细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性，证实他们就是全能干细胞。用这种
25、方法，每个胚胎可取得1520 干细胞用于培养。John D. Gearhart 在 Johns Hopkins 大学领导的另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后 59 周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞（primordial germ cell）。由此培养的 细胞株，证实具有全能干 细胞的特征。2000 年，由 Pera、Trounson 和 Bongso 领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人 ES 细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。2003，建
26、立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。2004 年，Massachusetts Advanced Cell Technology 报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代 40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这 是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。2012 年 2 月，赛莱拉“人干细胞生长因子在化妆品中的应用” 获得国家重大发明专利。2012 年 12 月，获批成立“广东省赛莱拉-暨南干细胞研究与储存院士工作站”。2013 年 05 月，赛莱拉“人
27、胎盘干细胞提取物冻干粉及其制备方法与应用”荣获国家重大 发 明专利。2013 年 12 月，人胎盘干细胞研究成果荣获全国工商联“科技进步奖优 秀奖”。干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域。中国在干细胞低温超低温气相、液相保存技术、定向温度保存技术及超低温干细胞保存抗损伤技术等处于世界领先水平。干细胞理论的日臻完善和技术的迅猛发展必将在疾病治疗和生物医药等领域产生划时代的成果，是对传统医疗手段和医疗观念的一场重大革命。采用干细胞治疗有着多种优势：低毒性（或无毒性），即使不完全了解疾病发病的确切机理治疗也可达到较好的治疗效果，自身干细胞移植可避免产生免疫排斥反应，对传统治疗方法
28、疗效较差的疾病多有惊人的效果。2011 年 5 月， 自然期刊发表研究报告指出，用皮肤干细胞制成的细胞组织，尽管是来自同一病患体内的细胞，都可能受到病患体内免疫系统的排斥，这项报告让干细胞治病的前景受到挫折。研究人员是用与胚胎干细胞类似特点的皮肤细胞，制成诱发性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，简称 iPS 细胞）。这种细胞理论上可变为神经、心脏、肝脏或其他器官的细胞，也可进行移植，修补受损的器官。iPS 细 胞 2007 年最初制成时，科学家深感震撼，因为这种细胞具有胚胎细胞缺乏ips 细 胞在人类研究疾病工作中的用途ips 细 胞在人类研究疾病工作中的用途的两大优点，一是没有争议，无需毁坏人类胚胎；二是因用病患本身的皮肤细胞制成，所以应当不会受到免疫系统的排斥。但第二个理论上的优点从未经过实际检验，直至圣地牙哥加州大学的华裔生物学家徐阳(Yang Xu，音译）和同事在试验中才发现，用老鼠皮肤制成的 iPS 细胞，在属性相同的老鼠体内受到排斥。很多科学家也对这样的结果感到惊讶。高级细胞技术公司科学主管兰札说：干细胞的临床应用前景更加黯淡了。 他说，在老鼠身上的试验，不清楚是否在人类身上也产生同样结果，但一些科学家认为，结果可能相同。
