1、无菌线测试（S2S11）S1：设备出厂前作的验证，在设备生产厂家内部进行。S2：评估 COP/SOP 对无菌区的清洁 和杀菌效能验证。S3：包装材料外表面灭菌消毒效果测试。S4：包装材料内表面灭菌消毒效果测试。S5：注入无菌环境测试。S6：整个生产线的无菌效果验证，认证从灭菌到无菌缸到充填及旋盖的全部过程。S7：注入封盖系统的无菌环境验证，认证从灭菌到充填及旋盖的整个过程的无菌效果。S8：隔离系统的抗污染能力验证。S9：运输测试，测试运输期间，对微生物敏感的产品在分类卡车上，贮存和装卸条件下对包装完善方面的影响。S10：饮料生产允许测试，确认无菌线是有能力对不同类型的饮料产品进行大批量的生产。
2、S11：饮料生产接受测试，证明无菌生产线是具备商业长期产生不同饮料的能力的。无菌线 S2 验证 SOP目的：评估 COP/SOP 对无菌区的清洁和杀菌效能应用：无菌灌注系统无菌区的设备外部表面，此钢片测试应于培养基注入测试之前进行第一部分：准备工作1. 仪器与试剂：移液枪（1ml ，0.1ml ，0.01ml，推荐另配一把 1-9ml）以及枪头各 100 个，钢片 50 片（Krones 提供接种好的钢片） ，100ml 塑料圆盒 50 个，不锈钢托盘 3 个，锡箔纸 5 卷，平皿（塑料/玻璃均可） ，TSA 培养基，PCA培养基，石英砂、3M 胶带、扎带，针筒（1ml，10ml 各一个） ，
3、振荡器 1 台，摇床（采购中） ，Duran 瓶，或者三角瓶以制备培养基以及无菌水，2. 洗脱液配制：吐温 0.1% 、蛋白胨 0.1%、石英砂稍许、氯化钠 0.85%3. 其它：酒精灯、过滤膜、试管第二部分：操作要求1. S2 验证都应当在穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行2. 将样品按照验证程序要求，进行相应的处理，完毕后采用无菌取样的方式移出，进行微生物检验。3. 操作前，按照要求进行洗手、更衣、消毒等人员卫生程序。4. 不相关的人员严禁进入净化间，避免人为污染的存在。5. 所用工具事先完成消毒处理。6. 操作过程中产生的废弃包装物、废弃样品和防护用品等物品及时销毁，并对相关操作
4、区域和接触过的区域进行彻底消毒处理。7. 凡是使接触或可能接触过菌种的地方都要进行消毒，尤其是生产车间内的灌装间，凡是接触过菌种的设备，工具，仪器表面必须进行高温灭菌或者相对应的处理8. 接种室的准备：一房间作为接种室，内部有恒温设施，温度计，湿度计，生石灰（作为干燥剂） ，桌，椅各一张。出入此房间人员必须严格控制或者指定专人房间保管钥匙第三部分：S2 验证步骤1 设备进行 CIP 和 SIP，SIP 时用温度测试条对微生物实验室中的杀菌锅，灌注 UHT 系统 SIP 温度，UHT 保持管末端温度进行验证2 着色试验，确定 S2 验证中所挂钢片的位置3 挂钢片之前，由 Krones 人员做阳性
5、对照试验，10 组4 无菌钢片安置（协助 Krones 人员做）：钢片使用塑料扎带或者双面胶，悬挂或黏贴在之前通过着色实验确认的 30 个点上。安置钢片时，可由三人进行操作，一人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置人，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。钢片安置完毕之后，关闭灌装机各个密封门，并且确认。之后，进行 COP/SOP，并且期间有相关人员对于 Hygiene Center上的参数，与灌装间 COP/SOP 的实际时间进行确认。关于 COP/SOP 参数，需事先从 Ecolab 取得，后依照此数据，在 Hygiene Center 核对，并且通过秒表记数验证数据准确性，确认方
6、法亦从 Ecolab 得到。 （需设记录实验的表格）5 无菌钢片卸载（协助 Krones 做）：COP/SOP 结束后，卸载钢片，可由三人进行操作，一人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置人，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。钢片背部以及边缘，需使用酒精或者PAA 稀释等消毒液进行消毒，但是消毒液绝对不允许接触钢片正面，消毒完毕后，用 9ml 无菌水冲洗，并立即放入 100ml 洗脱液的塑料盒中，上下摇晃20 分钟。6 洗脱液膜过滤（微生物品控员做）：洗脱液塑料盒摇晃 20 分钟后，置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，如产生泡沫，使用 100ml 无菌水加入滤杯助滤，取下
7、滤膜，放入事先准备好的培养基平板（事先倾倒好TSA 无菌培养基） 。实验后，平皿放入 35-38培养箱，48 小时后计数第四部分：S2 验证过程中无菌流体的取样从 S2 开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样。要求现场微生物 QC 取样，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。1 无菌水总出水口2 V401，V165，V825 无菌空气3 COP/SOP 时化学中心无菌空气4 COP/SOP 时化学中心无菌水第五部分：用差值法计算每片浓度为 6 log 的钢片所减少的微生物的数量级：R = log (C0) log (Ct), 即：R=数量级缩减量或者数量级毁灭量，C0
8、 =初试微生物数量和Ct =灭菌后微生物存活数量无菌区钢片测试可接受运行结果参考标准（COP/SOP）：5 log Spore test strip 6 log 细菌量 测试钢片通过 1 带菌钢片 至少杀灭每条带菌钢片上所含的log 微生物未通过 1 带菌钢片 1 片带菌钢片，被杀灭微生物量小于log无菌线 S3 验证 SOP目的：验证系统对包装材料外部表面消毒灭菌效果。应用：瓶，盖必须与即将投入生产线生产的瓶，盖设计形状，尺寸相一致第一部分：准备工作1. 微生物品控准备工作：移液枪（1ml ，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把 1-9ml）以及灭菌过的枪头各 100 个，细菌悬浊液，菌液
9、浓度确认后，将原液和 108 浓度的菌悬液冷藏待用， 装有洗脱液 100ml 的塑料圆盒 198 个（121 20分钟灭菌） ，无菌浇好 TSA 培养基的小平皿 250 套左右，和样品数量相当的0.45um 的无菌滤膜，无菌针筒（1ml，10ml 各一个） ，2. 洗脱液配比：吐温 0.1% 、蛋白胨 0.1%、石英砂稍许、氯化钠 0.85% 3. 小圆盒上用标签识别 5 个组和阳性对照4. 采样点所需物品准备无菌空气采样管、无菌空气取样器、无菌水取样器等，注意：除了正常采样数量，还必须增加化学中心的无菌空气和无菌水5. 至少 2L 无菌水（用于过滤冲洗）6. 无菌 9ml 稀释液，数量根据阳
10、性对照数量确定7. 75%酒精，35-38 的培养箱，取塑料袋放入紫外灯下杀菌后备用。酒精消毒不锈钢托盘备用 3 个，锡箔纸 5 卷，口罩若干，塑料手套若干，摇床，振荡器8. 准备接种用 PET 瓶至少 600 个（包括阳性对照、阴性对照、在实验过程中掉落损失）9. 强力剪刀 1 把，不锈钢剪刀 2 把 ，镊子 2 把，纸箱 30 个，10. 1500ppm PAA 2L（以 1L 烧杯/塑料杯盛放，保证能覆盖到整把剪刀以及镊子上沿） ，标签纸（根据样品个数准备） 11. 确认现场的 PAA 浓度符合要求第二部分：操作要求1. S3 验证都应当在穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行2.
11、将样品按照验证程序要求，进行相应的处理，完毕后采用无菌取样的方式移出，进行微生物检验。3. 操作前，按照要求进行洗手、更衣、消毒等人员卫生程序。4. 不相关的人员严禁进入净化间，避免人为污染的存在。5. 所用工具事先完成消毒处理。6. 操作过程中产生的废弃包装物、废弃样品和防护用品等物品及时销毁，并对相关操作区域和接触过的区域进行彻底消毒处理。7. 凡是使接触或可能接触过菌种的地方都要进行消毒，尤其是生产车间内的灌装间，凡是接触过菌种的设备，工具，仪器表面必须进行高温灭菌或者相对应的处理8. 接种室的准备：一房间作为接种室，内部有恒温设施，温度计，湿度计，生石灰（作为干燥剂） ，桌，椅各一张。
12、出入此房间人员必须严格控制或者指定专人房间保管钥匙第三部分：S3 验证步骤1. 生产部保证灌装机可以正常运行2. 生产部要在注入间内放置两张用于放置瓶子和剪瓶子的非木质桌子。3. 微生物工程师准工作（由克朗斯微生物工程师主导）：104 接种：将稀释至 106/105 菌悬液，用移液枪取 0.01ml/0.1ml 至验证所用 PET空瓶外表规定区域，在该区域作好标记，室温干燥 4-8 小时不等，具体数量和部位参照 Validation Protocol（可以事先备好生石灰做干燥剂） 。准备好 30 个1.25L 产品的纸箱，顶端开瓶口大小圆孔，安置倒置干燥之 PET 瓶，空瓶按照实际情况放置（比
13、如接种点为瓶底，瓶子要倒置插在纸箱上安放，干燥） 。4. 接种瓶上菌液干燥后，就可进行 S3。5. 接种后 PET 瓶，使用塑料袋，按照不同部位，将 175 个已接种的 PET 瓶分成5 个组别，从接种室转移到注入间，以 35 个一组（5 个备用） ，挂上风道。6. 按照规定最大灌装速度（比如 NT480 瓶型对应的 36000bph） ，进行验证。7. 杀菌后 PET 瓶不封盖，迅速从注入机出口运输带取出，放入已杀菌的速封袋，转移至指定区域，把 PET 瓶做标记部分剪下，放入洗脱液中（放置洗脱液与接种样品的小盒子，必须事先用标签纸标示清楚，待用） 。8. 将样品的洗脱液充分摇匀晃（接种在瓶口
14、罗纹部分的样品需要摇晃 25 分钟，其余区段产品摇晃 20 分钟） ，摇匀后将样品置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，取下滤膜，放入事先准备好的 TSA 培养基平板（事先倾倒好无菌培养基） 。将平皿放入 35-38培养箱，48 小时后计数。9. 每个阳性对照做 10-3 稀释，10 -4 稀释，0.1*10 -3 稀释各一次。阳性对照建议一共 5 个点，每个点 5 组。注意：a. 剪下带有标记的瓶子时，每完成一个瓶子的剪切，必须使用 1500ppm 的 PAA对双手，剪刀进行消毒。b. 由于剪切样品数量较多，建议两组人员进行操作，每组两人，一人剪瓶，一人为另一人消毒）c. 过滤时，使
15、用 100ml 无菌水加入滤杯助滤.d. 以上项目由克朗斯培训，微生物品控操作，同时由克朗斯微生物工程师主导。第四部分：过程监控取样由 Krones 提供取样培训、微生物品控取样，生产部协助通知取样时间、品控组长协助取样。从 S3 开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样（无菌水总出水口、无菌空气、Hygiene Center 无菌空气、Hygiene Center 无菌水、冲瓶无菌水、冲瓶无菌空气） ，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。现场的检测和巡检项目和正常时一致。第五部分：用差值法计算每个瓶子，瓶盖所减少微生物的数量级：R = log (C0) log (C
16、t), 即:R=数量级缩减量或者数量级毁灭量，C0 =初试微生物数量和Ct =灭菌后微生物存活数量外部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准：瓶子，瓶盖外部杀菌通过所有瓶子，瓶盖的每个接种点的生物负载量，至少减少3log未通过 1 瓶子，瓶盖的接种点的生物负载量减少量小于 3 log 无菌线 S4 验证 SOP目的：验证系统对包装材料内部表面消毒灭菌效果。应用：瓶，盖必须与即将投入生产线生产的瓶，盖设计形状，尺寸相一致第一部分：准备工作：1. 仪器与试剂：移液枪（1ml ，0.1ml ，0.01ml，推荐另配一把 1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液（枯草芽孢杆菌 ATCC 9372） ， 100ml
17、 塑料圆盒 150 个，不锈钢托盘，锡箔纸，平皿（塑料/玻璃均可） ，OSA 培养基，PCA 培养基，吐温试剂（0.1% Tween(界面活性剂 ) / 0.1% peptone(蛋白胨) 溶液） ，3M 胶带，扎带，针筒（1ml，10ml 各一个） ，振荡器，超声波洗瓶器，摇床， Duran 瓶或者三角瓶制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。2. 接种：10 接种：将稀释至 10 菌悬液，用移液枪取 0.1ml 至刚吹好的 PET 空瓶内/ 空盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/ 分布于空盖底部。10 接种：将稀释至 10 菌悬液，用移液枪取 0.1ml
18、至刚吹好的 PET 空瓶内/空盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/ 分布于空盖底部。具体数量参照 Validation Protocol，空瓶室温干燥 12-24 小时/空盖室温干燥 2-4 小时（可以事先备好生石灰做干燥剂） 。第二部分：操作要求1、 根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限对无菌线设备进行一次CIP, SIP/ COP, SOP，生产线运行平稳时开始进行 S4 试验。2、 接种 PET 瓶安置：菌液干燥后，就可进行 S4。接种后 PET 瓶，使用塑料袋，将 120 个已接种的 PET 瓶，从接种室转移到注入间，挂上风道。按照规定最大灌装速度（比如 NT
19、480 瓶型对应的 36000bph） ，进行验证。杀菌后PET 瓶中注入 100ml 无菌水后用无菌洁盖/ 铝箔封盖，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，开盖后加入对应量的无菌吐温试剂，细沙等,剧烈晃动20 分钟 （强烈建议使用超声波水浴，对样品进行洗脱） 。3、 空盖安置：使用托盘铝箔纸，将接种好空盖覆盖好，转移至注入间。从下盖槽整齐排列。建议接种盖与洗盖槽中其他盖，以颜色区别。按照规定最大灌装速度进行验证。杀菌后瓶盖，从盖取样口，用已杀菌之容器盛接（例如烧杯/平皿容器等） ，然后放入对应量的已加入无菌吐温试剂，细沙的小盒子中,剧烈晃动 20 分钟 （强烈建议使用超声波水浴，对样品进行
20、洗脱） 。4、 记录下每个样本运行中的中断与停顿，同时也要记录下瓶，盖铝箔的杀菌条件，冲洗条件以及其他关键的无菌系统测试运转的参数。5、 作为一个阳性对照，在当天使用的样品干燥后（干燥和当天使用后） ，检验在各个浓度的已接种的瓶子，瓶盖各 5 个，检验它们上面的生物负载量6、 作为一个阴性对照，取未接种的瓶子，瓶盖各 3 个，每个瓶子灌入100 ml 无菌吐温试剂，然后用无菌的铝箔或者瓶盖封口，然后将这些瓶子然后充分摇动瓶子 25 次，进行膜过滤对瓶中全部内容物(100 ml)进行检验，来检验三个瓶子，盖子的总菌数。第四部分：S4 验证过程中无菌流体的取样从 S4 开始至结束，工厂品控人员需依
21、据取样频率，进行微生物取样-无菌水总出水口，无菌空气，Hygiene Center 无菌空气，无菌水，以及冲瓶 /冲盖无菌水，无菌空气的取样，要求现场微生物 QC 取样，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。第五部分：用差值法计算每个瓶子，瓶盖所减少微生物的数量级：R = log (C0) log (Ct), 即：R=数量级缩减量或者数量级毁灭量，C0 =初试微生物数量和Ct =灭菌后微生物存活数量内部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准：已接种 5 log 细菌量的瓶子，瓶盖 已接种 6 log 细菌量的瓶子，瓶盖通过所有瓶子，瓶盖上含有 1 个单位菌体数量杀灭每个瓶子，瓶盖上每个至
22、少log 微生物 1 个瓶子，瓶盖含有 1 个瓶子，瓶盖上的未通过 1 单位菌体数量 被杀灭微生物量小于log无菌线 S5 验证 SOP目的：评价注入环境和设备外表面的无菌程度应用：这一测试在完成 CIP/SIP/COP/SOP 后和 LG 培养基测试之前进行的，同时这一测试将在 LG 培养基充填后再进行一次。第一部分：准备工作已倒入 TSA 无菌平皿（塑料/玻璃均可）7 个（2 个备用），无菌涂抹棒40 支，Duran 瓶，或者三角瓶以制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。温度测试贴条第二部分：实验前处理及实验过程1. 试验前确认：水处理、动力中心、灌装机、无菌水、化学中心处
23、于正常状态。2. 灌装机、无菌水进行 CIP、SIP ，参数确认，用温度测试贴条对微生物实验室中的杀菌锅，SOP 管路温度确认。3. 通过烟来确认无菌区域空气的流向。4. 灌装机进行碱性 COP、酸性 COP，SOP，参数确认5. 检测无菌区和洁净室的空气质量，在 1 立方米的空气里取 3-5 个样品。取样器可以选用 Merck MAS ESO 或者 Millipore 公司生产 M air T 的压缩空气取样器。选用 TSA 培养基培养。6. 对灌装机进行尘埃粒子计数。7. 灌装机进行 SOP。8. 做 S5 实验，根据公司标准进行涂抹取样分析。取样位置需包括：灌装阀，所有除菌后的喷嘴处，及其它可疑处。其中的一半用于分析总菌，另一半用于分析霉菌和酵母菌。记录取样点及各取样点选取的原因。9. 灌装机进行碱性 COP、SOP
