1、新洁尔灭消毒液消毒效果验证摘要：目的：评估新洁尔灭消毒液的消毒效果。方法：通过中和剂中和效果试验和消毒剂定量悬浮试验来验证。结果：三次独立的平行试验均能够在 10 分钟内使所有试验菌的数量至少下降 99.99%（至少下降 4个对数单位） 。结论：新洁尔灭消毒液的消毒效果符合使用要求，能够用于洁净区域日常的清洁消毒。 关键词：消毒效果 中和剂 定量悬浮 新洁尔灭（苯扎溴铵）：是一种阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂。用于皮肤、黏膜和小面积伤口的消毒。新洁尔灭为复方制剂，主要成分为苯扎溴铵，辅料为纯化水。本品为无色至淡黄色的澄明液体，最低浓度为 0.1%。 1、材料 1.1 培养基及试剂 营养琼脂培养基
2、、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、组氨酸、吐温 80、卵磷脂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、新洁尔灭消毒液 1.2 试验菌 金黄色葡萄球菌【CMCC（B） 26003】 、枯草芽孢杆菌【CMCC（B） 63501】 、大肠埃希菌【CMCC（B）44102】 、白色念珠菌【CMCC（F）98001】 2、方法 2.1 培养基配制方法 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养、改良马丁琼脂培养基按中国药典附录培养基及其制备方法项下配制。 2.2 中和剂和稀释液： 2.2.1 稀释液 0.03mol/L 磷酸盐缓冲液（PH7.27.4，下称 PBS） PBS 配制方法：将磷酸氢二钠 2.84g 与
3、磷酸二氢钾 1.36g 溶解于1000ml 纯化水中，分装，121、15min 压力蒸汽灭菌后备用 0.9%氯化钠溶液：称取 0.9g 氯化钠，溶解于 1000 ml 纯化水中，分装，121、15min 压力蒸汽灭菌后备用。 2.2.2 中和剂 在每升 PBS 缓冲液中加入 10g 组氨酸、50ml 吐温-80、5g 卵磷脂，分装，121、15min 压力蒸汽灭菌后备用。 2.3 菌液制备：（菌种要求不得超过 5 代，采用适宜的方法保存） 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的斜面培养物，加入 10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将菌种洗脱。然后吸出菌液（用管口带有薄的棉花的能过滤菌丝的无菌
4、毛细吸管）至无菌试管内，制成均匀菌液（菌液浓度不得低于 106cfu/ml） 。 取白色念珠菌新鲜培养物少许至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养 2 天，加入 10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将菌种洗脱。然后吸出菌液（用管口带有薄的棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，制成均匀的菌液（菌液浓度不得低于 106cfu/ml） 。 2.4 方法： 2.4.1 中和剂中和效果试验： 2.4.1.1 菌液组： 用 PBS 对制备的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌悬液进行 1ml9ml 的 10 倍系列稀释并用平皿计数法进行活菌计数，制成每毫升小于 100cfu 的菌液。取此金黄色
5、葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液 1ml 分别加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过45的融化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，每种菌液平行做 2 个平板。 用 PBS 对制备的白色念珠菌悬液进行 1ml9ml 的 10 倍系列稀释并用平皿计数法进行活菌计数，制成每毫升小于 100cfu 的菌液。取此白色念珠菌菌液 1ml 分别加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过45的融化玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，2328培养 3 天后计数，每种菌悬液平行做 2 个平板。 2.4.1.2 试验组（以金黄色葡萄球菌为例） 将消毒剂 1.0ml 与中和剂 9.0
6、ml 混合，制成中和产物（中和剂与消毒剂作用后的产物）溶液，再按以下步骤分组进行。 第一组：取消毒剂 4.5ml 于试管中，加入 0.5ml 制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用 10 分钟，吸取此混合液 0.5ml 于装有4.5mlPBS 的试管中，混匀，作用 10 分钟后，吸取此混合液 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过 45的溶化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做 2 个平板。 第二组：吸取消毒剂 4.5ml 于试管中，加入 0.5ml 制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用 10 分钟后，吸取此混合液 0.5ml 于装有4.5ml
7、 中和剂的试管中，混匀，作用 10 分钟后，吸取此混合液 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过 45的溶化营养化物琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做 2 个平板。 第三组：吸取中和产物 4.5ml 于试管中，加入 0.5ml 制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用 10 分钟，吸取此混合液 0.5ml 于装有4.5mlPBS 的试管中，混匀，作用 10 分钟，用 PBS 做 10 倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml温度不超过 45的溶化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做
8、 2 个平板。 第四组：吸取 PBS4.5ml 于试管中，加入 0.5ml 制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用 10 分钟，吸取此混合液 0.5ml 于装有 4.5mlPBS的试管中，混匀，作用 10 分钟，用 PBS 做 10 倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过 45的溶化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做 2 个平板。 第五组：吸取中和剂 4.5ml 于试管中，加入 0.5ml 制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用 10 分钟，吸取此混合液 0.5ml 于装有4.5mlPBS 的试管中，混
9、匀，作用 10 分钟，用 PBS 做 10 倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml温度不超过 45的溶化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做 2 个平板。 第六组：阴性对照组。分别吸取 PBS 于中和剂 1ml 加入无菌培养皿中，注入约 1520ml 温度不超过 45的溶化营养琼脂培养基，混匀，3035培养 48 小时后计数，平行做 2 个平板，应无菌生长。 2.4.1.3 重复上述操作，直至完成 3 次试验。 2.4.1.4 按照上述方法进行枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的操作，但白色念珠菌操作时，应使用玫瑰红钠
10、琼脂培养基，并且在2328培养 3 天计数。 误差率（%）=【（?三组均数-第三组回收菌落数?+?三组均数-第四组回收菌落数?+?三组均数-第五组回收菌落数?）3】/三组均数*100% 三组均数=（第三组回收菌落数+第四组回收菌落数+第五组回收菌落数）/3 2.4.1.5 结果判断： 第三、四、五组菌数相似，其误差率10%，第六组无菌生长，第一组不长菌或明显少于第二组，第二组菌数明显少于第三、四、五组。符合这些标准，表明中和剂可消除消毒剂对每个试验菌的作用，中和剂及其与消毒剂的中和产物对每个试验菌无毒害，判定所选择的中和剂为该消毒剂的中和剂。 2.4.2 消毒液定量悬浮试验： 2.4.2.1
11、试验组：（1）取 1 支无菌带塞试管加入 4.5ml 待验证消毒液。 （2）取 0.5ml 金黄色葡萄球菌菌液，接种于上述盛有消毒液的无菌带塞试管中，轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。 （3）10 分钟后，取上述混合液 0.5ml 与 4.5ml 中和剂中，混匀作用 10 分钟后，吸取原液或其稀释液 1ml 加入无菌培养皿中，细菌注入约 1520ml 温度不超过45的营养琼脂培养基，混匀，平行做 2 个平板，3035培养 24 小时后计数。 2.4.2.2 对照组：以稀释剂（PBS）代替待测消毒液，同时同以上步骤操作。 2.4.2.3 重复上述操作，连续做 3 次实验。 2.4.2.4 按照
12、前面的方法进行枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的操作，但白色念珠菌操作时，应使用玫瑰红钠琼脂培养基，并在2328培养 3 天计数。 3、结果 4、讨论 4.1 由结果可以看出通过中和剂中和效果试验可以确定，每升 PBS缓冲液中加入 10g 组氨酸、50ml 吐温-80、5g 卵磷脂可以中和新洁尔灭消毒液的消毒效果，因此，在日常消毒中应该避免以上物质的混入。 4.2 由消毒剂定量悬浮试验结果可以得出新洁尔灭消毒液能够在 10分钟内使所有试验菌的数量至少下降 99.99%，说明该消毒剂的消毒效果能达到要求，能够用于使用环境日常的清洁消毒。 参考文献： 国家药典委员会， 中华人民共和国药典（二部）M，中国医药科技出版社，2010 年版。 苏德模，马绪荣，药品微生物学检验技术M，华龄出版社，2007年 1 月第 1 版。 潘友文，现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术M，中国协和医药大学出版社，2004 年 4 月第一版。
