1、发根农杆菌介导的植物基因转化,发根是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，产生的一种形态上与植物气生根类似的根状器官.,发根（hairy root）是什么？,什么是发根农杆菌 ?,发根农杆菌（A. rhizogenes） 来自土壤, 呈棒(杆)状, 细胞质内有一种质粒(plasmid）, 叫诱根质粒（root inducing plasmid）, 简称 Ri 质粒, 与发根的诱导有关. 发根农杆菌能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 .,Ri质粒,Ri 质粒 TDNA区和 Vir 区的两个功能区. TDNA叫可转
2、移DNA区, 可插入到寄主植物基因组中，其中携带生根基因和冠瘿碱合成酶的基因.Vir 称致病区, 不插入到寄主植物基因组DNA中，但与TDNA的转移有关， Vir 区 缺失或突变则不能使感染的植物出现发根,发根农杆菌诱导发状根产生的原因?,发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导 Ri 质粒的Vir区基因群活化；在Vir区基因表达产生的酶作用下TDNA被切下；TDNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中；TDNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根,Ri 质粒感染过程,发状根的特点,生长迅速激素自养分化程度高遗传性状稳定,发根农杆菌感染植物的方法,向植物体直接注射对植物
3、外植体进行接种感染与原生质体共培养,含抗生素的培养基上继代培养除菌选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 .一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖25005000倍）,发根的筛选及增殖培养,发根的鉴定,形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 组织水平：GUS 活性的测定或 NPTII 酶的检测 细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：Southern Blot, PCR等方法,影响发根农杆菌转化的因素,1. 菌株: 常用菌株有 LBA9402，ATCC1583
4、4，R1601，TR105，A41027，A42659 等,目前超过100,000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4000种新化合物的速度增加.植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等,植物是自然界中最好的化工厂,植物次生代谢物的获得,直接从野生植株中分离提取植物细胞培养优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地; 缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化植物发根培养,对Ri质粒的敏感性：双子叶植物 单子叶植物，草本植物木本植物在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体 将菌株、植物、外植体进行不同
5、的组合，会导致发根诱导率的变化,2. 植物种及外植体的种类,水溶性酚 ：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、对羟基苯酚 等，可激活Vir区基因表达光照,3. 理化因子的影响,感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等,4. 其它,影响发根培养及次生代谢物合成的因素,培养基： 基本培养基、碳源、氮源、pH值等植物激素：发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响前体物质诱导子： 可刺激代谢物的产生和分泌,5. 培养方法固体培养液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养两步培养法两相培养法反复成批培养补料成
6、批培养6. 生物反应器发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器,发状根的用途,遗传育种植物有用次生代谢产物工业化生产,丹参发根生物反应器大规模培养技术,丹参(Salvia miltiorrhiza)是我国传统中药,具有活血化淤,通经止痛的功能.丹参中含有二类活性成分: 脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物.二萜醌类化合物,如丹参酮I, 丹参酮IIA,隐丹参酮等,具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用,是治疗心血管系统疾病的重要药物.酚酸类化合物,如丹酚酸A, 丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸, 原儿茶醛, 丹参素等,具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、改善肾功能等作用。但是由于丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长, 加之近年来产地环境污染和为防病虫喷施农药等原因, 便得原料药的供应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。在短时间内大量繁殖有效成分含量高且无污染的绿色丹参原料药就成为丹参这种重要中药资源开发与利用的当务之急 .,
