1、犊牛运输应激综合征的实验诊断国家肉牛牦牛产业技术体系岗位专家 邓立新摘要：郏县某红牛养殖场在犊牛经长期运输到牛场后，大量犊牛出现流鼻涕，精神不振，食欲较差，偶有发烧腹泻等症状的出现。为研究引起犊牛应激反应的病原菌，试验起初从郏县某红牛场刚经长途运输的犊牛的新鲜牛鼻涕里进行了细菌的提取，培养，分离和鉴定。实验结果表明混合菌对头孢西丁，链霉素，比较敏感。分离的细菌在形态特征，生化特性，等方面与葡萄球菌基本相同，药敏试验结果表明该菌对头孢呋辛，米诺环素比较敏感。对青霉素，氨苄西林等耐药。试验结果为临床用药及预防提供了理论依据。关键词：犊牛应激；鼻涕; 细菌的培养和分离鉴定；药敏试验；攻毒实验；关键词
2、：犊牛应激；鼻涕; 细菌的培养和分离鉴定；药敏试验。犊牛的应激反应一般是机体受到外界非特异的有害因子的刺激下所表现出来的病理现象。运输应激综合征是长途贩运所致的多种应激原造成的机体免疫力下降，各种病原体趁机侵袭造成的以呼吸道，消化道，乃至全身的病理性反应。运输过程的应激原主要包括摩擦，碰撞，饥渴，环境，气候等身体反应和运输过程的心理应激反应。主要表现为食欲差，精神萎靡，气喘，流鼻涕，咳嗽伴有发烧腹泻等症状。犊牛的运输应激综合征使犊牛的饲喂地有了很大程度上的限制性。该病的产生使犊牛的生长发育受到的极大的限制甚至影响成年后的生产性能，并且影响犊牛的市场流通，给养牛业造成极大的损失。随着社会的发展，
3、养牛业的拓展，犊牛的长途运输是难免的，科学研究的进步能够对细菌进行快速准确的鉴定，能够极大的改善运输过程中犊牛的应激反应。该实验把从河南省郏县红牛养殖场无菌采集运输应激犊牛的鼻涕病料进行病原菌的提取，培养，分离，镜检，生化试验，及药敏试验。以期为犊牛应激反应的预防和防治提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料普通肉汤培养基，普通琼脂培养基，药敏片（头孢西丁 30ug/片；链霉素 10ug/片；20 片/瓶） ，游标卡尺，棉签。1.1.1 试验地点,时间河南农业大学分子生物学 325 实验室 2018 年 3 月到 5 月间进行。1.1.2 病料棉拭子无菌采集养殖场犊牛鼻涕1.1.3 主要试剂普
4、通肉汤培养基，血浆，药敏片，革兰氏染液，双氧水，香柏油，三脚架，石棉网，1.1.4 主要仪器设备无菌操作台，恒温培养箱，高压灭菌锅，冰箱，显微镜，试剂盒，酒精灯，载玻片，钓菌环，香柏油，试管，平皿，等1.2 方法1.2.1 普通肉汤培养基的制备称取普通肉汤培养基 18g，加入蒸馏水 1 升，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，封口，高压灭菌 15min，待至常温放冰箱备用。1.2.2 病料处理将普通肉汤培养基分装于小试管中，用棉签取少许病料，将带有病料的棉签接种于试管中，放置于摇床上，促进细菌的生长，对混合菌做药敏试验。1.2.3 细菌的分离培养将病料接种于普通琼脂培养基上，划线分离培养单个菌
5、落挑取颜色，形态不同的单个菌落接种于普通肉汤培养基 37培养 1224 小时。1.2.4 显微镜的观察将分离出细菌涂抹在滴有生理盐水的无菌玻片上，使用油镜增加显微镜的分辨率，调节粗细焦螺旋，观察待检测菌体，菌体呈球形，直径 0.8um 左右，排列成葡萄串状，无芽孢，鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。1.2.5 细菌的鉴定用接种环钓取一环菌液，在玻片上进行固定和革兰氏染色，进行镜检，根据菌落的颜色形态做出初步判断，各类细菌按相应生化特性做进一步鉴定，细菌革兰氏染色结果为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列，无芽孢，菌膜。1.2.6 细菌的进一步鉴定1 触酶试验（catalytic experime
6、nt）：又称过氧化氢试验，具有过氧化氢酶的细菌能催化过氧化氢成为水和原子态氧继而出现氧分子，出现气泡，大多数需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌属阴性，以此区分葡萄球菌和链球菌，挑取固体培养基上的待检菌落，置于洁净玻片上，滴加百分之三过氧化氢溶液数滴，观察结果，如图所示 QQ2 葡萄糖发酵试验（glucose fermentation experiment）：细菌有不同的酶系，根据其具有不同利用碳源的能力，进行比较，把接种细菌的培养液用移液管接种在葡萄糖发酵管中，试验结果如图所示，酚紫的颜色由紫色变为黄色。产酸的过程不产气。3 玻片凝固酶试验（coagulase test of glas
7、s slide method ）：凝固酶是鉴定金黄色葡萄球菌的重要试验，葡萄球菌可产生凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固，在一张洁净玻片中央加一滴生理盐水，用接种环取待检菌液与其混合，制成悬菌液，观察结果如图 QQQ1.2.6 药敏片试验1 测试菌液的制备：选取郏县红牛养殖场鼻涕中已经鉴定出的金黄色葡萄球菌，从保存培养基的菌落中提取 23 环，接种于营养肉汤试管中，放在恒温培养箱中培养 24 小时，留置备用。2 药敏片的试验：把混合菌用无菌涂抹棒均匀涂在培养基上，待菌液被完全吸收后，用无菌镊子把药敏片贴在培养基上。观察混合菌在培养基上的抑菌环。用
8、20ul 的移液枪把菌液在涂布棒的涂抹下均匀使 20ul 的菌液涂抹在培养基上，待菌液被培养基吸收完全后用无菌镊子把药敏片贴在培养基上每个平板上贴 34 个药敏片，用记号笔做好相应的药敏片名字，纸片的间距不少于 24mm，纸片外围距培养基边缘不少于 15mm。将做好的平板放入 37恒温无菌培养箱中 12 小时后取出用游标卡尺测量出抑菌环的直径，依据抑菌环的大小来评断该菌对药物的敏感性，抑菌环越小，则敏感度越低，抑菌环越大，则敏感度越高。抑菌环和敏感度呈正比例关系。试验如图 1-23 结果的判断标准：抑菌效果依据药理学中的标准判定，抑菌直径大于 20mm 为极敏感，1519mm 为高度敏感，10
9、14mm 为中度敏感，10mm 以下为低敏6-91.3 结果与分析1.3.1 分离菌的培养特性1 普通琼脂培养基：分离菌在培养 24 小时后呈圆形，凸起，边缘整齐，不透明表面光滑的菌落，直径 2mm 左右，生长良好。2 血液琼脂培养基：形成的菌落比普通琼脂稍大，部分可产生溶血毒素，在菌落周围形成 B 溶血环3Baird-Parker 氏培养基：菌落呈圆形，凸起，圆形，边缘为一浑浊带。1.3.2 生化特性1 该细菌不产生吲哚，MR 阳性，V-P 试验不定，具有还原性。多数能分解葡萄糖，麦芽糖，产酸不产气。分离菌的生化实验结果Table of the biochemical test result
10、s of isolated bacterial1.4 药敏试验（drug sensitive test）通过药敏片试验对细菌进行药敏试验，药敏片通过抑菌环的大小来判断该细菌对药物的敏感性和耐药性，数据如图所示Table 2 the test results of drug sensitive test paper method药物 A B C D E F G头孢呋辛 32.22 33.90 33.53 31.28 33.21 32.87 31.66头孢他啶 22.85 21.44 21.33 20.69 20.97 22.56 21.41多西环素 9.65 10.23 9.60 10.04 9
11、.54 8.76 8,31呋喃唑酮 19.94 21.25 20.41 20.32 22.01 21.32 19.87四环素 7.27 7.94 9.54 8.12 8.45 8.33 7.34图 1-2注：数字表示抑菌圈直径，单位（mm） ，D:表示犊牛Note:figures show that the antibacterial circle diameter ,unit(mm).D:said calf;figures show that the separat ion of strains.结果与分析:药敏试验结果表明，金黄色葡萄球菌对头孢类药物比较敏感，对四环素类药物不敏感。 1.4
12、 小鼠的攻毒试验通过金黄色葡萄球菌对小鼠的致病性，感染率和毒力的研究。造成小鼠金黄色葡萄球菌感染模型，确定细菌的敏感药物，为金黄色葡萄球菌的预防和治疗提供良好的动物模型。1 饲养健康小鼠 10 只，4 只做为对照组，6 只作为实验组，饲喂小鼠饲料和无菌水。2 将小鼠分组，做上标记，给 6 只实验小鼠腹腔注射剂量 1 毫升的菌液，对照组用无菌注射液腹腔注射同等的生理盐水，感染后每隔四小时观察一次，连续观察半月，做出统计；3 临诊症状，病鼠初期大多表现精神不振，采食，饮水减少，被毛耸立，肛周红肿，后期病鼠极度衰弱，重症病鼠衰竭死亡。腹腔注射生理盐水的对照组无明显变化，接种金黄色葡萄球菌的小鼠精神萎
13、靡，陆续死亡，为临床提供实验基础模型。1.5 讨论犊牛在长途运输后，细菌会在犊牛免疫力低下的情况下侵袭入体内，使犊牛产生一系列的病理变化，该实验对郏县红牛养殖场应激反应的犊牛中进行了细菌的分离，培养和鉴定，其中葡萄球菌为优势菌株，引起犊牛的一系列身体和心理上的应激反应，给畜牧业造成了巨大的损失，也给养牛业带来了极大的限制。为了解决这一问题，设计此实验，期望能给养牛业转移形成的应激反应的损失降到最低。兽医临床用药抗菌药的大量使用，使得临床畜牧动物耐药性的产生，导致良畜的不良反应增多，虽然抗菌药的大量使用，解决了临床上寄生虫，细菌，病毒的入侵，带来了巨大的经济效益。但是由于大量不规范的滥用药物，导
14、致现在好多细菌和病毒耐药性的产生。不同的药物对不同细菌的作用明显，此实验研究此细菌最为敏感的药物使得良畜的耐药性降低，所以在研究过程中必须切实合理使用抗菌药，并掌握适应症药物动力学，药物代谢动力学，制定合理的方案，减少药物在良畜体内的残存。对防治人畜共患病有重大的意义，有利于提高全民身体素质。本次试验的主要目的是为了确定犊牛长途运输应激反应的主要病原菌及其敏感的药物。为了预防和防治犊牛的应激反应以及后期犊牛健康的成长，不至于影响犊牛的生长发育以及繁殖，为了合理并且达到预期的用药效果，第一，要严格掌握该反应的适应症，第二，要根据药物在体内的代谢和残存量，适量控制用药量，第三，要防治用药的不良反应，第四，要选择最适合，最敏感的药物，以防治抗菌药的滥用。合理的遵循临床用药原则，是药物和畜群的经济利益发挥到最大。
