1、SUR1 基因的组织定位 目录 摘要 . 错误 !未 定义书 签。 1前言 . 错误 !未 定义书 签。 1.1 研究背景 . 错误 !未 定义书 签。 1.2User fusion 技术简介 . 错误 !未 定义书 签。 2.实验材料和方法 . 错误 !未 定义书 签。 2.1SUR1 启动子的克隆 . 错误 !未 定义书 签。 2.2 转化农杆菌 . 错误 !未 定义书 签。 2.3 农杆菌侵染法侵染拟南芥 . 错误 !未 定义书 签。 2.4Basta 筛选转基因拟南芥 . 错误 !未 定义书 签。 3.结果 . 错误 !未 定义书 签。 3.1SUR1 启动子 User fusion
2、克隆结果 . 错误 !未 定义书 签。 3.2 启动子 PCR 产物与载体 连接 . 错误 !未 定义书 签。 3.3 大肠杆菌中 SUR1 启动子 菌落 PCR 检测结果 . 错误 !未 定义书 签。 3.4 SUR1 启动子农杆菌的 PCR 检测 . 错误 !未 定义书 签。 3.5 Basta 筛选结果 . 错误 !未 定义书 签。 4.讨论 . 错误 !未 定义书 签。 参考文献 . 错误 !未 定义书 签。 致谢 . 错误 !未 定义书 签。 SUR1 基因的组织定位 摘要： 芥子油苷是一类十字花科植物所特有的硫代产物， 芥子油苷代谢 与植物防御反应密切相关，且某些芥子油苷的降解产物
3、具有很高的抗肿瘤活性，因而其代谢及调控机制的研究备受关注。随着生物信息学的发展以及芥子油苷合成途径中相关基因的鉴 定 ， S UR1 基因 参与 硫苷生物 合成模式 三 个阶段中 硫苷 核心结构的形成 阶段， SUR1 表达的 C-S lyase SUR1 能 将 S-烷基硫代烷肟 转换成硫代肟基酸 。 本研究以模式植物拟南芥为实验材料 。 采用 USER fusion， 构建载体，农杆菌转化， GUS 染色等方 式 ，观察其表达模 式，完成其组织定 位 ，结果用以和其他已知的芥子油苷合成路径中的一些相关的基因进行表达上的对比，通过这中方式探讨 SUR1 基因在 芥子油苷的合成途径 中的功能意
4、义，以 及 SUR1 基因时空表达的特异性 。 关键词： 芥子油苷 ,拟南芥 ,SUR1 ,USER fusion SUR1 基因的组织定位 Abstract: is a c lass of sulfur -c ontaining sec ondary metabolism outc omes spec ialized in Cruc iferous plants. Gluc osinolates have an important role in plant defense and some of the gluc osinolates degradation produc ts c an
5、prevent c anc er in humans. Today, the researc hing about the gluc osinolates metabolism and its biosynthesis regulation is under the spotlight. Along the development of bioinformatic s and the demonstration of the new genes w hic h involve the biosynthesize of gluc osinolates,， SUR1 take part in th
6、e proc ess Constructing the glucosinolate core,which can happen non-enzymatically, the produced S-alkylthiohydroximates are converted to thiohydroximates by the C-S lyas e SUR1。 In this study， w e use the model plant Arabidopsis as experimental material,USER fusionc onstruc t vec tors, Agrobac teriu
7、m-mediated transformation,GUS ,to observe expression pattern and c omplete its tissue loc alization.the results are usedand some other know n mustard oil glyc oside synthesis route related gene expressionc ontrast. the func tional signific anc e of the SUR1 gene in the biosynthesis ofgluc osinolates
8、 this w ay SUR1 gene temporal and spatial expression spec ific ity. Key word Glucosinolates , Arabidopsis thaliana , SUR1 , USER fusion SUR1 基因的组织定位 1 前言 1.1 研究背景 硫代葡萄糖苷 即芥子油苷 简称硫苷 ，是一种 含氮、硫的 化合物。 芥子油苷广泛分布于 16 个不同科的双子叶被子植物中 , 它们分别是十字花科( Brassicaceae) 、藜 木科 ( Bataceae) 、钟萼木科 ( Bretschneideraceae) 、白花
9、菜科 ( Capparaceae) 、番木 瓜科 ( Caricaceae) 、大戟科 ( Euphorbiaceae) 、环蕊科 ( Gyrostemonaceae) 、池花科 ( Limnanthaceae) 、辣木科(Moringaceae) 、瘤药树科 ( Pentadiplandraceae) 、商陆科( Phytolaccaceae) 、海 桐花科 ( Pittosporaceae) 、木犀草科 ( Resedaceae) 、刺茉莉科( Salvadoraceae) 、烈味三叶草科 ( Tovariaceae)和旱金莲科( Tropaeolaceae)1。最 主要 是 存在于十字花
10、科植物中 ， 十字花科植物 中超过350 个属和 3 000 个种都可 以合成芥子油苷。 是一种 重要 的 植物次生代谢 产物 。芥子油苷既分布于植物的生殖器官 ( 花序、角 果 /果实、种子 ) , 也存在 于营养器官 ( 根、茎、叶 ) 2。在同一 植物中芥子油苷的含 量和成分明显依赖 于株龄3, 4和组织器官而发生变化 。 近年来，由于其在黑芥子酶作用下的分解产物异硫代氰酸盐在人体抗癌方面的健康功效而不断受到大家的重视。增加食品中的芥子油苷含量和充分发挥其分解物的生物有效性已经成为现今的一个研究热点。 芥子油苷 一般贮存于植物细胞液泡中，而芥子酶贮存于特定的蛋白体 中，一般情况下二者是分
11、离的，当植物组织受到病原体或虫害侵袭时，细胞组织被破坏，芥子酶与硫苷相遇，发生反应，将硫苷水解成 异硫氰酸盐（ Isothiocyanates）、硫氰 酸脂（ Thiocyanates） 和腈类（ Nitriles） 等降解产物 7。 硫苷及其降解产物能调节十字花科植物的生长素代谢，平衡体内的硫元素，缓解硫素胁迫，保证植物 正常生长发育 ， 抵御 病原体及虫害侵袭， 此外，还对癌症 的发生 起阻断作用 。 在植物防御与人类营养学上起着重要的作用，具有很高的生物学价值与经济价值。 芥子油苷通常由 -D-硫葡萄糖基、硫化肟基团以及来源于氨基酸的侧链 R组成 (图 1) 。 SUR1 基因的组织定位
12、 目前至少有 120种不同的结构 被确定 5 。根据侧 链的氨基酸来源可以 将芥子油苷分为脂肪族芥子油苷 (侧链来源于甲硫 氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸 ) 、芳香族芥子油苷 (侧链来源于苯丙氨酸和酪氨酸 )和吲哚族芥子油苷 (侧链来源于色氨酸 ) 3个类群 。 硫苷生物合成模式大致可分为三个阶段 ： 氨基酸侧链的延长、硫苷核心结构的形成和葡萄糖配基侧链的二次修饰 。 硫苷的有无与含量的高低是由基因来控制的 ， 相关的主要合成和调节基因 参与硫苷合成的三个阶段。 氨基酸或氨基酸侧脸延长筒源无可经由细胞色素 P450(CYP450)家族的CYP79s(CYP79subfamily)和
13、 NADPH催化转变为相应的肟。肟形成后被CYP83s(CYP83subfamily)和 NADPH催化产生不稳 定的酸式硝基化 合 物 或 氧 化 氰 。二者 均可与硫供体 半胱氨酸结合，在 谷胱甘肽 硫转移酶 作用下生成 S-烷基硫代烷肟 ，之后在 C-S裂解酶 的催化下生成的硫代肟基酸 经 S 葡萄糖基转移酶的作用下，与活化硫酸盐 的磺基结合形成芥子油苷的硫核心结构，该核心结构之后再需要经过羟基化、甲基化、去饱和化、磺化、葡萄糖基化等种种次级修饰形成不同的芥子油苷。 本研究 所涉及的 SUR1基因 是 在硫苷核心结构的形成阶段 起重要作用：在硫苷核心结构形成的阶段中 SUR1表达的 C-
14、S lyase SUR1 能 将 S-alkylthiohydroximates（ S-烷基硫代烷肟） 转 换成 Thiohydroximates（硫代肟基酸） 6从而保证 下一步反应 的进行 (见图 2)。 本研究 旨在完成该基因的组织定位。 SUR1 基因的组织定位 图 2：脂肪族与吲哚族芥子油苷的生物合成路径 1.2 USER fusion技术简介 USER fusion技术 的 基础理论是依赖于 PCR引物的使用 ， 该 引 物 包 含 一 个12-nt 5 尾部 中至少 含 有四 个 脱氧胸腺嘧啶核 苷 （ Ts） 被替 换成脱氧尿苷（ Us） ，之后 PCR产物被 尿嘧啶 -DN
15、A糖苷酶 （ uracil DNA glycosidase即 UDG） 处理 ， 这种酶可以 选择性 的切 除尿嘧 啶碱基 ，而保 留磷酸 二酯骨 架的 完好性 ， 缺失 的碱SUR1 基因的组织定位 基位点会使碱基互补配对不稳定。 实验结果中，引物的 3 突出端 在退火 过程中同样的在 PCR扩增载体 3突出 端互补配对 。 处理后的 PCR产物和载体能形 成一个可被转入一个不需结扎的大肠杆菌之中的稳定环状杂交产物。 随着技术 的发展，第二种 酶被 引入 PCR产物 的处 理中 T4核 酸内切 酶 V，可 以在 3端 破坏 DNA磷酸二 酯骨架 制造 一个脱 碱基 位点。 因此 ， UDG和
16、 T4内切 核酸酶 V连 续作 用在PCR产物 中， 与 一个 3端 含有单 U残基的 引物 一起 ， 可以有效 地 被 用于克 隆 。商用公司通过一种简单的双酶处理法将两种酶混合到一起， 称为 USERTM enzyme mix， 并 作出一 定程 度上的 优化改 进。 这种 USER fusion技术被 认为 是一种 高效率且通用性强的技术。 8 2实验材料与方法 2.1 SUR1启动子的克隆 启动子是一段 位于 结构基 因 5端上游区的 DNA序列 ，能活化 RNA聚合 酶，使之与模 板 DNA准确 地相结 合并具 有转录 起始的 特异性 ，即 启 动子是 RNA聚合酶 特异性 识别 和
17、 结合的 DNA序列 ， 启动 子是基 因的一 个组成 部分， 控制 基 因表达 的起始 时间和 表达 的程度 ， 本身 不控制 基因活 动 ， 而 是通 过与称 为转录 因子的蛋白质结合而控制基因活动的。 一般认为目 的基因上游约 2kb即包含目 的基因启动子 片段 ， 由于所需克隆 的片段较长，故选 择 USER fusion方法来克隆 这段目的基因片段， 这种方法通用性强，并且准确率和效率都比较高 。 2.11 多聚酶链反应 扩增 包含 SUR1启 动子全 长 cDNA的质 粒模 板， 寡核苷 酸引 物序 列从 Invitrogen公司购 买， 依照 说明 书使用 PfuTurbo CX
18、 Hotstart DNA聚合 酶行驶 反应 。 所涉及引物序列见表一 （ A、 B） 引物 序列 SUR1启动子 FP 5 -GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT-3 SUR1启动子 RP 5 -GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGAGTTCTT-3 表一（ A） SUR1启动子引物 SUR1 基因的组织定位 引物 序列 SUR1启动子 fusion FP1 5 -ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT-3 SUR启动子 fusion RP1 5 -ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG-3 SUR1
19、启动子 fusion FR2 5 -ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG-3 SUR1启动子 fusion RP2 5 -AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG-3 表一（ B） SUR1启动子 USER fusion 引物 2.12 DNA纯化 根据厂家说明书用 QIAquick PCR纯化工具对 PCR产物进行柱相纯化， 纯化产物以原体系的三分之一的蒸馏水进行洗脱。 2.13 纯化的 PCR产物与预备载体的结合 等体积的纯化 PCR产物连同等体积的带有 PacI/Nt.BbvCI的预备载体pCambia3300一起，于琼脂糖 凝胶上进行跑胶， 通过 条
20、带亮度 分析相对 浓度， 决定 混合配比 3:3:3:1 。 2.14 用 USERTM enzyme mix处理 一微升 10 TE buffer【 100mM Tris-HCl, 1mMEDTA (pH 8.0)】 、 1U 的 USERTM enzyme mix(1U/L)加到 8 L预备载 体和 PCR纯化产物的混合物，反应在 37的温度下孵育 20分钟，接着在 25的条件下反应 20分钟，预备载体在反应混合物中的量大概占 0.01 pmol. 2.15 转化 全部 10L的反应混合物与 50L感受态大肠杆菌细胞进行热激反应 2.16 质粒的准备与限制性分析 依照厂家说明书，使用 Ge
21、nEluteTM 质粒小量制备工具， 4ml过夜培养，被纯化的质粒用 50L的水洗脱， 在一个 20L包含 1 NEB Buffer 250mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol (pH 7.9)和 100L/ml BS A的反应体系中 每两微升质粒 用 10U的 SpeI,37条件下切割 2小时 。 SUR1 基因的组织定位 在含有卡那霉素固体培养基中筛选， PCR和酶切鉴 定重组质粒 ，取阳性克隆 菌落 。 载体示意图如图 3 图 3： 载体示意图 所构建 载体为二元载体， Basta为在植物体中的筛选标记， Kana为
22、菌体中 的筛选标记。所连接的 GUS基因用于后续组织定位之用。 2.2 转化农杆菌 重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压 2 500 kV em；电容 25 F；电阻 500 Q。电 击 3 5 ms后，取出电击杯，迅速加入 800 L的 LB液体培养基，混匀并转移至 1 5 mL的EP管中，在 28震荡培养 3 h；取 100 ,L菌液涂布于含 Gen(50 ,g mL)和 Kan(50 ,g mL)的 LB平板中 28培养 24 h，即可长出阳性克隆。 阳性克隆的菌落 PCR与酶 切鉴定。随机挑取 单菌落，在装有 1 mL的 LB和 1
23、 5 mL的抗生素的离心管中 28 培养 12 h左右。取 5O L培养物，煮沸 5 rain， 5 000 r rain离心 2 min，取 1 2 ,L上清进行 PCR扩增后电泳检测。选取菌落 PCR验证后的菌液抽提质粒，并用 BstE 1I和 Bgl 1I双酶切后，电泳检测。 2.3 农杆菌浸染法侵染拟南芥 SUR1 基因的组织定位 前期准备： 取 150ml 含相应抗生素的液体 LB 培养基，接 入 2-3m l 准备好的 农杆菌菌液，大摇过夜至培养基由红色转为黄色。将培养后的 15 0ul 农杆菌菌 液导入灭过菌的 50ml 离心管中， 4， 3000rm p 离心 15m in 弃
24、上清，加入 50ml 1 2 MS，将菌泥搅起 。 用于 侵染 的 1 2 MS 配方：（每 150 ml 菌液加 50 ml 1 2 MS 液） MS 大量 5 ml 蔗糖 10 g 水 95 ml 表面活性剂 20 ul 常用 1 2 MS 配方（ 1 L）： 10X 大量元素 50 ml 100X 微量元素 5 ml 100X 铁盐 5 ml 蔗糖（ 1%） 10 g 琼脂粉 8 g 拟南芥生长土壤： 腐殖土：蛭石 =1:1 混匀，装双层袋子，高压 121灭菌 40 分钟 注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。 种子消毒： 30%H2O2+85%乙醇 1:4 混合 取 250 微升混合液加 入种子种用枪头吹 打 40S， 放在滤纸上晾干， 然后铺在 1 2 MS 平板上 。 4冰箱中放 置春花 1- 5 天，一般 新种子春花时间长 点。 168 光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。 后续操作 1 种植健康的拟南芥直到开花。 在 种子种下后 浇水盖膜 ， 盖膜的目的 是为了保持水分 。 移栽拟南芥后还需要盖 3到 4天的膜。 2 初次开花时将花蕾剪掉以促进更多花 枝 的 增生 ，修剪后越 4至 5天 可 使用，
