1、实验三 动物细胞的原代培养 【 实验目的 】o 掌握实体组织材料的原代细胞培养的基本思路。o 掌握动物组织中细胞的分离和原代培养的方法。【 实验原理 】 （参考教材 P128） o 原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养o 是一项基本技术o 是建立细胞系的第一步【 实验原理 】 o 原代细胞的分离和制作常采用的方法n 有悬浮细胞的分离方法n 实体组织材料的分离方法o 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液 ,可采用n 机械分散法n 消化分离法【 实验原理 】 o 酶消化分离常采用n 胰蛋白酶n 胶原酶o 胰蛋白酶是广泛应用的消化剂，对蛋白质
2、有水解作用，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。 【 实验材料与器材 】 本实验用品 o 每组 1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞培养瓶、移液枪（ 1ml）及枪头o 每组 2个：离心管、培养皿o 全班共用：离心机 1000 r/min、 37 水浴、 5%CO2细 胞 培养箱、倒置显微镜 【 实验试剂 】 本实验用o 酒精o 无钙、镁 PBSo 0.125% 胰蛋白酶o 无血清培养基o DMEMo 含 20% 小牛血清的 DMEM培养液【 实验方法 】o 出生 13 d SD乳鼠（雌雄兼用），用碘酒、酒精消毒，剪开胸腔，无菌条件下取出心脏，剪去心房及主动脉， PBS溶液清洗心室组织数次。o
3、 将心室组织剪成 13 mm3碎块后，用 0.125%胰蛋白酶37 水浴消化 10 min，打匀后吸出上层，并加无血清培养基终止反应，反复数次。最后将细胞混悬液 1000 r/min离心10 min收获细胞。细胞沉淀用 PBS溶液和 DMEM清洗数次。o 弃上清液，加含 20%小牛血清的 DMEM培养液制成细胞悬液，置于培养瓶中，用差速贴壁法，于 37 、 5%CO2培养箱中培养 90 min。o 将含有心肌细胞的培养液转移至另一培养瓶中继续培养，培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩。o 心肌细胞的培养及动态观察。实战程序o 第一步骤：取心脏o 第二步骤：洗心室、剪碎o 第三步骤：消化组织，获得细胞o 第四步骤：清洗细胞，培养细胞实战程序 第一大步骤：取心脏o 出生 13 d SD乳鼠（雌雄兼用），用酒精消毒o 腹部向上，剪开胸腔o 无菌条件下取出心脏
