1、荧光实时 定量 PCRrt-qPCR定义实时荧光 定量 PCR(rt-qPCR)： 在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对 PCR过程进行 实时监控，以此实现对 初始模板 的定量分析。 Rt-qPCR的应用mRNA表达的研究 微小残留病变的检测 肿瘤耐药基因表达的研究 病毒感染的定量监测 PCR基本原理 试管中进行的试管中进行的 DNA复制反应，依据复制反应，依据1.DNA半保留复制的机理半保留复制的机理2.体外体外 DNA分子于不同温度下可变性和复性的分子于不同温度下可变性和复性的 性性质质 通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使1.双链双链 D
2、NA变成单链变成单链2.单链单链 DNA与人工合成的引物退火与人工合成的引物退火3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 基本步骤 变性：加热使双链 DNA变为单 链（ 94 ，30s） 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 （ 55 ， 30s） 延伸：耐热 DNA聚合酶按 53方向催化以引物为起始点的延伸 反应（ 7072 ，3060s）示意图 Real-time定量 PCR仪是 在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个 PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条 曲线，最后 通
3、过标准曲线对未知模板 进行定量的分析。SYBR Green SYBR Green 能 结合到双链 DNA的小沟 部位 ， 只有 和双链 DNA结合后才 发 出 荧光 ， DNA双链 分开 就不发出 荧光 ，随 PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关联。 理论上来说， PCR反应过程中生成的 DNA产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环， PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗，最终 PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个 PCR反应过程中，只有在指数期， PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（ PCR产物量 =初始模板量 2N， N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准确的。 在 相同的条件下，进行复制 扩增，每 扩增一个循环，通过 检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的 含量，记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（样本的域值循环数 Ct），次数 越多就说明目标基因在原本的样品里越 少，即初始模板的量越少。
