天然抗肿瘤药物筛选方法的研究进展.doc

1、天然抗肿瘤药物筛选方法的研究进展 前言 肿瘤是严重威胁人类 生命的常见病、多发病 ， 其死亡率仅次于心血管疾病而列居第二，并且其发病率还在持续上升 1。 目前， 临床上常用的化疗药物有 40余种，在肿瘤治疗中发挥着 重要作用，但也面临着严峻 挑战，如许多实体瘤尚无有效的药物，肿瘤的抗药性及抗癌药物严重的毒副反应等问题。因此，寻找和开发新的高效、低毒的抗肿瘤药物是医学界重要的研究课题 2。 大量的研究工作表明 ， 天然产物来源的抗肿瘤药物 毒副作用小，并且从天然产物中筛选抗肿瘤药物的概率比合成药高得多 , 由于天然药物具有 这些 化学合成药无法比拟的优越性，因此 越来越受到人们的青睐 1。 但是

2、如何从数目庞大的天然产物中 高效地 筛选出具有抗肿瘤活性的分子 , 是目前药物研发亟待解决的问题之一 3。 随着分子生物学和分子肿瘤学的发展 ， 抗肿瘤药物筛选方法经过了多次修改 。笔者对近年来 几种常见的 抗肿瘤天然药物的筛选方法综述如下。 1.细胞水平筛选抗肿瘤药物 采用针对疾病的筛选方法，选取 代表各种 常见实体瘤的人类肿瘤细胞株，以培养细胞为实验模型，检测天然药物及其提取物或单体的体外抗肿瘤作用。 体 外实验作为初筛，关键在于测定肿瘤细胞的活力，最常用也是比较 快的两 种方法是 ：第一种代谢测定法 ， 细胞还原 MTT 或 XTT 产生一种衍生物 ， 其颜色强度与活细胞数成正比 ， 且

3、可用自动分光光度计连续记数 ； 第二种方法是应用蛋白染料sulforhodamine B， 颜色强度也与活细胞数成正比 4。细胞水 平的药物筛选模型具有材料用量少、耗时 短、成本低和大规模筛选等优点，但容易出现假阳性结果，并且不能判断药物的组织特异性 5。 2.基于肿瘤 的产生 机理筛选抗肿瘤药物 肿瘤 (癌症 )并不是一种疾病 ， 而是临床病理表现不同、预后各不相同的多种疾病的组合，其病因及发病机制极为复杂，肿瘤的发生是一 个多因素 、多 基因突变、多步骤、长时间逐渐演化的过程 6。 现代肿瘤分子 生物 学的发展使肿瘤发病机理正在逐步阐明， 针对 机理 的 抗肿瘤 活性成分 筛 选 趋势已形

4、成 。 2.1 诱导细胞凋亡 细胞凋亡是细胞在一定生理和病理条件下，由基因调控的主动有序的自我消亡过程。 肿瘤与细胞凋亡具有非常密切的关系。细胞在各种因素作用下 ，以 “凋亡”的形式清除老化的 或已受损的细胞时，由于某种因素抑制或破坏了细胞凋亡机制，致使细胞凋亡发生障碍，继而导致细胞继续生存和不断生长，最终演变为肿瘤 。 许多天然产物就是通过一种或者几种不同机制来干扰肿瘤细胞生长 、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的 7。 2.1.1阻滞肿瘤细胞增殖周期 诱导凋亡 细胞周期分为 G1 期 (DNA 合成前期 ) 、 S 期 (DNA 合成期 ) 、 G2 期 (

5、DNA 合成后期 ) 和 M 期 (有丝分裂期 )。此外细胞在完成分裂后有一个 G0 期 (相对静止期 )， 此期决定细胞是再进入 G1 期继续分裂还是不再分裂而保持静息或进行分化 8。细胞周期调控的异常是肿瘤产生的一种内因。细胞周期的进展需要大量的胞内外信号的配合 ， 如果缺少适当的信号 ， 细胞将不能从一个阶段转向下一个阶段 ， 这个点称为检定点 ， 这种现象称为周期阻滞 ，其可诱导细胞发生凋亡 9。 传统中药苦参的主要成分苦参碱 （ 1） 具有抗炎、抗病毒、抗纤维化等多种药理作用，近年研究发现苦参碱还具有 抗肿瘤作用， 其 对人肝癌细胞 BEL-7402，IC50 为 1g/L。 金艳书

6、 10等发现，苦参碱可将人肝癌细胞周期阻滞在 G0/G1 期，诱导人肝癌细胞发生凋亡，从 而 发挥其抗肝癌作用。 从金丝马尾连提取的生物碱碱甲 hemanzine（ 2） 在体外对各种癌细胞有明显的抑制作用，其 IC50 在 0.5-1g/L之间，可阻断 G1 期细胞向 S 期过渡 , 其 杀细胞作用有 细胞周期特异性 。槲皮素（ 3） 近年来也被发现具有细胞周期抑制作用。刘丽娟 11等发现槲皮素能抑制白血病肿瘤细胞 HL-60 的生长 ， IC50 为 10 mmol/L。它能将细胞周期阻断在 G2/M 期，并且这种阻断作用可以 随着从培养基中移去槲皮素而 发生逆转。 崔燎 12等人从凤尾蕨

7、科植物半边旗 (Pterissemipinnata) 中得到新化合物 F-A（ 4） ，用其 对 HL-60 和 K562细胞作用 24 h后，对两细胞株的 IC50值分别为 7. 6 mg/L和 9. 1 mg /L，进一步研究发现该化合物有 G2/ M 期阻滞作用。 （ 1） （ 2） （ 3） （ 4） 2.1.2 抑制拓扑异构酶的活性 DNA 拓扑异构酶是一种调节 DNA 空间构型的重要核酶 ， 与 DNA 的复制、转录、重组等密切相关 ， 根据其断裂 DNA 单、双链的不同 ， 又分为 TOPO和 。由于 DNA 的超螺旋程度影响着机体的活动 ， 而拓扑异构酶的作用正是调控 DNA

8、的空间构型 ， 于是 DNA 拓扑异构酶顺理成章的成为抗肿瘤药物作用的重要靶点 13。 研究表明，许多天然产物正是以拓扑异构酶为作用靶点 ， 通过影响拓扑酶的活性 ， 干 扰 DNA 复制及基因的表达进而发挥抗肿瘤作用。 Itoh14等对从印度萝芙木 (Rauwolfia serpentina Benth)中分离得到的 27 个化合物进行了 Topo和 抑制活性研究，测试结果显示，化合物 （ 5） 具有明显的 Topo和 抑制活性 ， 并且对人白血病细胞株 HL-60 也具有较强的抑制作用，IC50 为 67mol/L。 Clericuzio15等对 Leucopaxillus gentian

9、eus 的提取物进行 Topo 抑制活性测试 ，研究 发现 7 个 类似葫芦素的化合物均有活性， 这些葫芦素 类似物具有很强的活性 ， 其中化合物 （ 6） 对 NCI-H460 肿瘤细胞的活性 更是 达到了0.011mg/L 与拓扑替康 ( topotecan) 相当。 从 Amphimedon 海绵中分离得到的pyridoacridine 类化合物 （ 7） 具有抑制 Topo和 的活性 ， 并可以选择性稳定DNA-拓扑异构酶 可裂解复合物。在体外该化合物对多种肿瘤细胞株生长有明显抑制作用 ， 其中对黑色素瘤细胞株 SK-mel-5 的活性最强 ， IC50 为 130 nmol /L16

10、。 有文献报道 ，从云南省真菌 -地花菌 ( Albatrellus confluens) 中提取分离到的 Albaconol（ 8） 对多种肿瘤细胞生长的平均 IC50 值在 1.042.42g/ ml 之间 ，且能明显抑制小鼠肝癌 H22 和小鼠肉瘤 S180 的生长。刘明华 13等后来研究发现 Albaconol 的细胞毒活性与其抑制 TOPO 的活性有关。 （ 5） （ 6） （ 7） （ 8） 2.1.3 抑制端粒酶活性 端粒酶是位于细胞核内的一种逆转录酶 ， 由 hTR (端粒酶 RNA)、 hTP1 (端粒酶相关蛋白 1)和 hTERT (端粒酶逆转录酶 )三部分构成 17。 端

11、粒酶在肿瘤发生、发展过程中起重要作用，因为它能阻止端粒随细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老而成为永生化细胞，导致人类肿瘤 的发生。由此端粒酶成为开发新的抗肿瘤药的一个具有吸引力的靶点。 从土壤放线菌中分离出来的雷帕霉素 （ 9） 具有很强的免疫抑制作用，细胞毒试验结果显示雷帕霉素抗宫颈癌细胞的 IC5050nM。 Victoria L18等研究发现雷帕霉素能通过抑制 hTERT 的 mRNA 转录和阻滞 G1 细胞循环这两种途径来抑制肿瘤的生长。 一直以来 作为拓扑异构酶抑制剂的 化疗药喜树碱 （ 10） ，被发现对 HaCaT 细胞端粒酶活性的抑制作用先于细胞凋亡的发生，由此表明，喜树碱抗肿瘤作

12、用机制还与抑制端粒酶活性有关 19。 谢冰芬 20等对 来自天然产物的茶多酚进行了较为深入地研究，结果显示茶多酚对体外培养的人肺腺癌 A549， IC50为 35.76g/ml。 其重要成分 EGC（ 11） 的 抗肿瘤作用就是以端粒酶为靶点，抑制hTERT 的 mRNA 表达。 我国中草药冬虫夏草 (cordyceps sinensis) 的有效成分虫草素 （ 12） ，有直接抗肿瘤功能，对 Hep-G2 等多种癌细胞有明显的抑制作用，一直以来作为 DNA 延长链的终止剂。随着研究的深入，后有文献报道虫草素也 可导致肝癌细胞端粒酶活性下降 ， 抑制抗凋亡基因的激活，促进细胞凋亡 21。 （

13、9） （ 10） （ 11） （ 12） 2.1.4 抑制微管蛋白活性 几乎所有真核细胞的胞质中都有微管存在 ， 它的组合和解体对于细胞的正常生理活动尤其是细胞分裂相当重要 ， 对于这些过程的些许 影响都将直接导致细胞分裂失常甚至是细胞 凋亡。由于肿瘤细胞比正常细胞分裂 更快 更频繁 ，因此其对药物作用于微管所带来的影响尤为敏感， 这使得微管成为抗肿瘤药物作用的有效靶点 之一 22。 天然产物作用于微管有两种 方式 ：促进微管聚合，抑制微管解聚，从而抑制细胞分裂；或是抑制微管聚合，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止在有 丝分裂中期 23。 自上个世纪 90 年代以来 ， 来自天然产物的微管蛋

14、白抑制剂引起了研究者的广泛兴趣 ， 其中具有里程碑意义的是紫杉醇 (Paclitaxel, Taxol)的发现。紫杉醇 （ 13）是从短叶紫杉中被发现并分离 的， 属于二萜类化合物，具有很强的抑制肿瘤细胞活性 ， IC50 小于 10 nmol/L(耐药细胞株系除外 )， 研究表明紫杉醇可体外诱导微管蛋白在低温、不含 GTP 或 MAPs 条件下形成超稳定的微管结构 ， 对 Ca2+和低温的解聚作用有一定的抗性 ， 因而有抗肿瘤增殖作用 ，目前已经作为抗肿瘤药应用于临床 24。 从纤维堆囊粘菌 Sorangiumcellulosum 中分离出的大环内酯类化合物 epothilones A 和

15、B（ 14） 有和紫杉醇类似的活性， 能促进微管蛋白聚合并稳定微管 ， 以非常 低的浓度 抑制肿 瘤细胞的 生长， 对 MDR 细胞株CCRF-CEM/VBL100 的 IC50 分别为 0.02 和 0.002 mmol/L。 从箭根薯 Taccap lantaginea Andr1 中发现的甾体类化合物 taccalonolide A（ 15） ，能抑制人卵巢癌细胞株 SK-OV-3 扩散， IC50 为 2.59 mol/L， 是能使微管增厚 并形成异常的有丝分裂纺锤体的微管稳定剂 25。 从南非海域海绵 Hemias-terella minor 中分离得到的 hemiasterlinA

16、.B（ 16） 是细胞生长强效抑制剂 ， 其人工合成类似物 HYI2286对 18 种肿瘤细胞的平均 IC50 为 0.12.1nmol/L，具有较好的抗肿瘤活性。hemiasterlin 的抗肿瘤机理与其诱导环状微管聚集物的形成、去极化以及微管不稳定有关 26。 （ 13） （ 14） （ 15） （ 16） 2.1.5 抑制癌细胞 DNA 与 RNA 合成 DNA 和 RNA 是细胞繁殖和遗传的物质基础，起着遗传信息贮存、自我复制和控制蛋白质合成的重要作用 27。由于 DNA 和 RNA 是肿瘤细胞增殖的物质基础，所以它们可以作为抗肿瘤药物对肿瘤细胞的一个 重要作用靶点，在常用的抗癌药中，

17、有许多是通过嵌入 DNA 改变 DNA 的性质 或者直接抑制 DNA 与 RNA合成， 抑制肿瘤 生长 。 从 药用植物 重楼中分离提取到的重楼皂苷，在体外实验中，对艾氏腹水癌(EAC)、宫颈癌 U14、 RS615、 肝癌腹水型 Hep、 小鼠肉瘤 S180、小鼠肝癌 H22等细胞株有明显抑制作用 ， 其主要的药理作用为抑制 DNA 合成而发挥抗肿瘤作用 28。 紫草具有抗肿瘤作用 ， 艾郁葱 29等发现 其醇提物（ LE）也有此作用 ，其对人肝癌细胞株 SMMC-7721 的 IC50 为 12.5g/ml。 LE 通过抑制 DNA 合成诱导肝癌细胞凋亡，并且 LE 的增殖抑制作用具有肿瘤

18、细胞的选择性。 来自 加勒比被囊动物 Ecteinascidia turbinata 中的 四氢异喹啉生物碱 ecteinascidins743(17)，在体外和动物体内实验均显示 出 强的细胞毒和抗肿瘤活性，其中对 L1210 细胞的 IC50 为 0.5 ng/ml， 其抗肿瘤作用机理同样也是抑制 DNA 合成 30。 2.1.6 作用信号传导通路 细胞的生长主要依赖于自分泌、旁分泌和内分泌的各种生长因子，当生长因子与相应的受体结合以后，信号将以级联放大的方式转导至胞内，从而调节细胞生长和分化，因此，生长因子的合成、受体的表达与降解、分泌及数量、以及二者的结合能力都将对细胞的生长产生影响。

19、 在细胞内调节细胞增殖和分化的信号系统中 ， 重要的有有丝分裂原活化蛋白激酶 ( MAPKs)系统、磷脂酰肌醇 3 激酶 /蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路及蛋白激酶 C (PKC) 等 31。若 信号传导通路中某一环节发生异常，可引起细胞生长失控，表现出生长加快、恶性分裂、凋亡受阻、侵袭转移等异常现象 ，是肿瘤发生的重要因素 。由于常规细胞毒药物在杀伤肿瘤细胞的同时 ， 也抑制其它正常的生长旺盛细胞 (如表皮细胞、生殖细胞等 )增殖，因此近年来抗肿瘤药物研发热点转向调节肿瘤细胞迷乱的信号转导通路来抑制其生长或促进凋亡 32。 在天然产物中， 儿茶素 （ 18） 白藜芦醇 33 (19

20、) 、姜黄素 34 (20)均 具有明确的抗肿瘤作用，已被证明是某些生长因子信号通路的强效抑制剂。 儿茶素是绿茶的主要成分，在癌细胞治疗中可以调节众多信号途径，最有可能通过直接抑制ERK1/2 和 Akt，从而抑制表皮生长因子受体的信号转导途径。 白藜芦醇可以抑制人单核细胞白细胞介素 -8 基因的转录，下调表皮生长因子的分泌，从而抑制癌细胞的增殖，其对白血病 HL-6 细胞的 IC50 值 为 75. 64mol/L。 而 姜黄素已被证明能够抑制配体诱导表皮生长因子受体的磷酸化和 基因表达以及抑制细胞周期蛋 白 D1，来抑制细胞生长，其对人乳腺癌 MCF-7 细胞作用的 IC50 值为 18.

21、 5mol/L。 （ 17） （ 18） （ 19） （ 20） 2.2 抑制肿瘤 新生 血管生成 血管生成在癌症的发展过程中起重要作用。血管生成是指组织利用既存血管产生新血管的过程，绝大多数肿瘤组织在其生长过程中，会诱导新血管的生成，以提供肿瘤生长所需的营养和氧气，同时通过血管向其他组织输送转移细胞，并在机体的其它部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。研究表明， 在其生成过程中血管内皮生 长因子 (VEGF)以及酪氨酸激酶受体 (VEGFR)具有极其重要的作用，目前已发现有许多天然药物及其有效成分可以通过多种途径来抑制肿瘤新生血管的生成 35。 人参皂甙 Rg3（ 21） 是存在于中药人

22、参中的四环三萜皂甙，在体内具有明显的抑瘤作用。潘子民 36等用人参皂苷 Rg3 做动物实验，结果发现实验组肿瘤组织 VEGF mRNA 的表达量、 VEGF 蛋白表达量和 MVD 显著低于对照组，从而得到结论 Rg3通过下调肿瘤组织中 VEGF mRNA和 VEGF蛋白的表达量来阻滞肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的转移。 小檗碱 （ 22） 作为抗菌药已有悠久的历史，而娄金丽 37等研究发现小檗碱在体外能明显抑制多种肿瘤细胞 (如 PG、 PAa、A549、 BEL-7402、 MGC-803 及 B16-BL6 等 )的增殖， 并进一步指出 小檗碱能明显抑制 bFGF 生成，使细胞周期阻滞在 G0

23、/G1 期，从而抑制肿瘤新生血管 的形成，促进细胞凋亡。而 前文 提及的 白藜芦醇 (19)、姜黄素 (20)它 们抗肿瘤的作用机制也包含抑制肿瘤血管的生成， 姜黄素更是有望被开发成为一种新型的肿瘤血管生成抑制剂 38。 2.3 诱导细胞分化 恶性肿瘤细胞就形态、功能等方面而言 与未分化的 胚胎细胞 很 类似。诱导分化治疗是指通过药物诱导，使肿瘤细胞向正常细胞转化，同时对正常细胞无杀伤作用 ，并且几乎没 有骨髓抑制等 副反应 。诱导肿瘤细胞分化及逆转是当前肿瘤分子生物学中一个重要的研究领域。 文献表明，板蓝根二酮 B9（ 23） 能抑制肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780细胞增殖，

24、具有诱导分化作用，可降低端粒酶活性的表达 39。当归多糖 能 诱导K562 细胞向红系、粒单系细胞分化 ，对人白血病细胞株 K562 细胞增殖有明显的抑制作用 27。 钱军 40等在进行榄香烯乳 （ 24） 对体外培养人肺癌细胞株超微结构的研 究中发现榄香烯乳 在体外对各种肺癌细胞的 IC50 为 25-45.5 g/ml，对体外肺癌细胞具有一定的诱导分化作用。 （ 21） （ 22） （ 23） （ 24） 结束语 抗肿瘤药物的筛选已 由 过去 针对化合物的筛选体系转变为针对疾病的筛选体系 ， 但目前所应用的筛选系统只适合于随机筛选 ， 比较理想的筛选体系应该是以机理为基础的或针对机理的筛选

25、系统 41。随着肿瘤发病机制 被 逐步阐明， 人们对肿瘤细胞恶化过程中 的许多新靶点有了更深入 的了解。如今，抗肿瘤基因、生长因子及其受体、蛋白激酶及信号传导通路、 DNA 拓扑异构酶和微管蛋白等都是可供利用的抗肿瘤药物的作用靶点，并且针对这些靶点研究和开发了许多新的天然抗肿瘤药物。 尽管 近年来在抗肿瘤药物的筛选方面取得长足发展， 但 无法 掩盖 其分子机制方面的研究 存在片面性和单一性的不足，所以 今后工作重点就是进一步加强基础理论研究，运用新理论、新技术、新方法阐明肿瘤发病机制， 为研制新型抗肿瘤药物奠定 理论基础 ；另外 鉴于当 代科学发展分工越来越细、综合越来越强的发展趋势， 研究人员 还 需 集中多学科优势，通力合作，各显其能 。只有这样 才能更加准确、 快速 的筛选出具有抗肿瘤作用的药物，有效的抑 制肿瘤这个人类健康的 杀手，更好地为人类的健康服务。