1、冷 冻 保 存 技 术 胚胎冷冻保存 精子冷冻保存 卵细胞冷冻保存胚胎保存分为1.短期临时保存，动物早期胚胎在 0 4 条件下暂时停止发育（可逆），因此胚胎可以在 04 低温情况下保存 2 3d。2.长期冷冻保存，将胚胎贮存在 196 超低温下长期保存的方法。这是 20世记 70年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。胚胎冷冻保存精子的保存常温保存通过降低精液 PH维持一定的酸性环境抑制精子的活动，或采用冻胶环境来阻止精子活动，减少其能量消耗，使精子保持在可逆的静止状态又不失受精能力 。低温保存主要在抗冷剂保护下降温至 0 5 保存，利用低温抑制精子活动，降低能量消耗，抑制微生物生
2、长。可通过加入卵黄 ,奶类等抗冷休克物质，避免产生不可逆的冷休克现象发生冷冻保存将精液在 -79 干冰或者 -196 液氮中保存，是目前精液保存最广泛使用的一种技术。在超低温条件下，精子的代谢活动完全被抑制，处于静止状态。卵细胞冷冻保存胚胎冷冻保存的意义 长期保存珍贵或濒临灭绝的动物资源 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率； 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施； 便于国际间交流； 替代种畜引种。 渗透性： 甘油、乙二醇（ EG）、丙二醇（ PG）和 DMSO等，防止溶质效应。 非渗透性： 蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、 PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，
3、并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。基础液： mPBS（改良）、 TCM-199、 PBS、HEPES等，最常用 mPBS。 抗冻剂的种类及作用特点：分子量小于 100，易于渗透特点：分子量大，不进入细胞玻璃化的概念： 是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。玻璃化溶液（ VS）： 细胞内液抗冻剂： 这种抗冻剂 分子量小，容易透过细胞膜， 使其内部迅速达到玻璃
4、化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 细胞外液抗冻剂： 这种抗冻剂 分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（ BSA）等。上述两种抗冻剂组合后，用基础液 mPBS调制成各种玻璃化溶液。抗冻剂的种类及作用 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。 胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤 常规冷冻法： “植冰 ”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。 超速冷冻法： 非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。 玻璃化冷冻法： 应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。 胚胎冷冻保存方法
