1、基质金属蛋白酶在牙周病变中的研究进展 刘宇， 口腔医学 1101， 摘 要： 牙周病是 威胁 人类口 腔健 康的 重要 疾病 之一 。基 质金 属蛋 白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs)作为降解胶原纤维和细胞外基质的重要酶类 ,对牙周组织的破坏起着至关重要的作用。目前 ,人们已认识到 MMPs 在牙龈炎症中具有重要的作用 , 对 MMPs 的研究有利于控制牙周病的发生和发展。 关健词： 基质金属蛋白酶，牙周病变，基质金属蛋白酶抑制剂 牙周病 (periodontal disease)是发生在牙支持组织的慢性细菌感染性疾病，包括牙龈炎和牙周炎，主要症状为牙龈
2、炎症和出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动和移位等。第三次全国口腔健康流行病学调查表明 ,我国成年人中约 80%-97%患有不同程度的牙周疾病 1。牙周病也已成为成年人牙齿丧失的首要原因 2。 近年来的研究发现 MMPs 及其抑制因 子 (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)是牙周病发生过程中具有重要作用的蛋白水解酶。牙周炎的重要病理过程是牙周细胞 外 基 质 ( extracellular matrix, ECM) 的降解 ,ECM 构成细胞生活的微环境 ,胶原占据其主体。MMPs 与 ECM 中胶原、蛋白多糖等代谢关系密切 ,在牙
3、周炎的发生发展过程中起着重要作用。 本文就近年来 MMPs 在牙周病变研究中的进展总结如下。 1 MMPs 概述 基质金属蛋白酶家族 (MMPs)是一类生物活性依赖于钙离子和锌离子的内肽酶家族 ,具有降解细胞外基质的能力 3 。 1962 年 ,Gross 与 Lapiere 最先于蝌蚪中发现了基质金属蛋白酶家族的第一位成员 胶原酶 4。到目前为止 ,人类研究已发现 25 种 MMPs, 分为五类。 1.1 MMPs 结构 大多数 MMPs 具有不同的一级结构 5,但所有 MMPs 的结构都是在 5 个结构域 (信号肽区、前肽区、催化结构区、纤维连接素样区和血结合素样区 )的基础上增加或减少而
4、成6(图 -1)。经典的 MMP 结构需含有两个结构域 ,分别为前肽结构域和催化结构域。前肽结构域由大约 80 个氨基酸组成 ,存在一个高度保守的氨基酸序列 :PRCGV(N)PD,其中的半胱氨酸对酶原形式的维持起重要作用。在酶原的激活过程中，这个结构域就会被水解掉。在所有 MMPs 的催化结构域中都含有一段十分保守的氨基酸序列： HEXGHXXGXXH，其中的三个组氨酸可以与酶活性中心 Zn2+结合而形成配位键，从而对酶的催化活性起重要作用 7。除了 MMP-7、 -26 外 ,其他MMPs 在碳末端还含有一个血结合素样结构域，它被认为可以介导 MMPs抑制剂与酶的互作及与细胞受体间的联系。
5、 1.2 MMPs 分类 基于底物特异性、序列相似程度及结构域的构成情况，大多学者将 MMPs 分为五类：胶原酶、明胶酶、基质水解酶类、模型 -MMPs(MT-MMP)及其他 MMPs8。 每一类 MMPs 中包含多种生理病理特性不同的酶，总结于表 -1 中。 图 -1. MMP 结构示意图 表 -1. 基质金属蛋白酶家族（只包含主要胞外基质底物） MMPs 分类 编号 分子量 （ kd ） 水解底物 胶原酶 间质胶原酶 MMP-1 55/45 COL-I, II, III, IV, V, 噬中性细胞 胶原酶 MMP-8 75/58 VII , VIII , X, XI, 胶原酶 -3 MMP
6、 -13 60/48 FN, GL, PLP, PGs, TN, 爪蟾属 胶原酶（胶原酶 -4） MMP-18 55/? pro -MMP-2, -9 明胶酶 明胶酶 -A MMP-2 72/66 GL, COL-I, IV, V, VII, X, XI, XIV, EL, FN, LN, PLP, PGs, VN, 明胶酶 -B MMP-9 92/86 pro-MMP-9, -13 基质水解酶 基质水解酶 -1 MMP-3 57/45 COL-II, III, IV, V, IX, X, XI, EL, 基质水解酶 -2 MMP -10 57/44 FN, GL, LN, PLP, PGs,
7、 TN, VN, 基质水解酶 -4 MMP -11 51/44 Pro-MMP-1, -7, -8, -9, -13 MMP -19 ?/? 釉质水解酶 （ enamelysin） MMP-20 ?/? 牙釉蛋白 金属弹性 蛋白酶 MMP-12 54/45/22 EL, COL-IV, GL, FN, VN, LN, PG 模型 MMPs MT1-MMP MMP-14 66/56 Pro-MMP-2, -13, MT2-MMP MMP-15 72/? COL-I, II, III, EL, FN, GL, LN, MT3-MMP MMP-16 64/52 PGs, TN, VN MT4-MMP
8、 MMP-17 ?/? 其他 MMPs 基质分解素 MMP-7 28/19 COL-IV, X, EL, FN, GL, LN, PGs, PLP, TN, VN, pro-MMP-1, -2, -9 其中几种主要基质金属蛋白酶的作用范围如下 9-10(表 -2): 表 -2 几种 MMP 生理学功能 名称 来源 生理学 功能 口腔疾病 中生理学作用 MMP-1 正常情况下存在于机 体 牙 龈 上 皮 细胞、牙周膜成纤维细胞及牙槽骨边缘细胞 创伤愈合 角化细胞迁移、上皮再生 血小板聚集 细胞迁移 细胞增殖 在局限型侵袭性牙周炎中诱导胶原降解 MMP-8 中性粒细胞合成 ,同时也存在于牙本质细胞
9、中 在 牙周组织退化中发挥中心作用 抗炎 对龋病、牙周病起到一定的诱导作用 MMP-13 纤维母细胞 抗炎 破骨细胞活化 释放 bFGF 参与牙周病的形成 ,但其对牙周组织的破坏机制尚不统一 2 MMPs 的调节 MMPs 在体内的表达、激活以及对底物的分解过程都受到严格的调控。MMPs 在体内以活化和非活化两种状态存在，两者之间需要精确的调节作用。正常情况下 ,机体分泌 MMPs 的量较少，机体处于正常的运转状态。当机体出现某些异常情况时 ,这种信号传导至细胞，在细胞上转录调控，并且合成分泌 MMPs,使 MMPs 的量超过正常范围。反之酶的合成和分泌则停止， MMPs 再次失去活性。如同其
10、他蛋白质一样 ,这种调控可通过以下几个不同水平实现：转录水平的基因表达调控 ;转录后 mRNA 稳定性、蛋白质的翻译与酶原分泌的调控 ;酶原激活的调控以及激活后抑制剂对其活性的调控。值得注意的是 ,ECM 被 MMPs降解后形成的碎片可以加强 MMPs 的表达 12。在胞外环境中 ,抑制剂和活化调节等因素也会影响 MMPs的活性。 2.1 转录水平的基因表达调控 在转录水平上 ,有生长因子、激素或其他化学物质参与调节。被广泛研究的两个因子为白介素 -1 (IL-1 )和转化生长因子 - (TGF- )。IL-可以促进 MMPs 的表达 , 而TGF-在多数细胞中则抑制其基因的表达 11。 2.
11、2 酶原活化的调节 MMPs 既可以被体内存在的天然激活剂激活 ,也可以在体外被特定的化学物质所激活。另外有些 MMPs 也可激活其他的 MMPs。 关于 MMPs 激活的机制目前尚未明晰 ,但比较公认的学说是“半胱氨酸开关”学说。 该学说 13认为当 MMPs 以酶原的形式存在时 ,活性中心 Zn2+除了与催化结构域保守序列中的三个组氨酸形成配位键外，还与前肽结构域保守序列中的半胱氨酸形成一个配位键 , 此时酶的活性中心被覆盖，因而没有催化活性。激活剂可以使酶的活性中心暴露，从而使 MMPs 发挥作用。机制为：（ 1）某些激活剂可直接打断半胱氨酸 -Zn2+之间的配位键 ,一个水分子得以进入
12、并取代半胱氨酸 ,从而使酶的活性中心暴露 ,底物进入该疏水区域而被催化降解；（ 2）有些激活剂可以将前肽段去除 ,半胱氨 酸 - Zn2+打开 ,使酶活性中心暴露而激活；（ 3）另外，有些激活剂还能从 MMPs 的羧基末端水解掉一个小肽段 ,从而使其进一步被激活而形成分子质量更小的超活性形式。（ 4）某些激活剂可以改变 MMPs 的空间构象 ,使其发生某种程度的扭曲 ,当扭曲产生的张力大于打开半胱氨酸 -Zn2+的键能时 , 半胱氨酸 -Zn2+打开而 MMPs 被激活。 2.3 活化后调节 MMPs 可被广谱的血浆抑制剂2-巨球蛋白 ( 2-M)所抑制 ,更为重要的是 ,可为 TIMPs 所
13、抑制 14-16。目前 ,在脊椎动物中已发现 4 种 TIMP(表-3)。 表 -3 MMPs 抑制剂（ TIMP） 家族 蛋白质 分子量 （ kd） TIMP-1 28.5（糖蛋白） TIMP-2 21（非糖化蛋白） TIMP-3 27（糖蛋白） 24（非糖化蛋白） TIMP-4 23（非糖化蛋白） TIMP 可与激活以后的 MMPs 1 1 结合，形成高亲和力、非共价的复合物，从而抑制 MMPs 活性。并且， TIMP 可以与 MMPs 的前肽形式相作用 14，阻止或延缓 MMPs 由酶原转换为激活状态。 TIMP 的表达可被众多的因素所调节。许多与细胞生长和功能相关的因子 也可以促 进
14、TIMP 的表达，包括 IL-1、 IL-6、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、TGF-、肿瘤坏死因子 - (Tumor Necrosis Factor- , TNF- )等。有趣的是 ,这其中很多因子也参与MMPs 和基质蛋白质表达的调节。这些因子的基因包含相同的转录因子结合区域 ,提示它们可能具有相同的调控机制 14。 3 MMPs 与牙周病变的关系 在龈沟处，胶原是胞外的主要成分。细菌所致牙周炎症最终会导致牙周附着丧失和骨的破坏。研究已证明在活动期牙周炎 中 ,MMPs 在牙龈组织的破坏过程中发挥了作用 17。 3.1 MMPs 在牙周病变中的作用
15、机制 用多克隆抗体 ,借助亲和细胞化学技术在牙周炎病人结合上皮的结缔组织中可以检测到被胶原酶水解的 I 型胶原酶片段 ,证明胶原酶存在于牙周炎病人结合上皮的结缔组织中 18。作为 PMN 蛋白的一种，乳铁蛋白可以转运 MMPs。因此在龈沟液中也可以检测到活化的 MMPs 或未活化的 MMPs。宿主细胞来源的胶原酶参与牙周组织的降解、附着丧失。如前文所述， MMPs 酶原激活有一系列的机制 ,未活化的 MMPs 暴露活性中心后即成为活化的 MMPs，从而将胶原分解为两个片段 (3/4 片段的羧基端 ,1/4 片段的氨基端 ), 破坏牙周结缔组织19-21。正常情况下 ,胶原酶主要由中性粒细胞分泌
16、。在牙周炎中 ,致病菌会刺激成纤维细胞、巨噬细胞等产生细胞外基质降解酶。与此同时 ,这些细胞还能产生纤维蛋白溶解酶原激活物 ,将纤维蛋白酶原转化成为纤维蛋白酶 ,继而激活潜在形式的基质金属蛋白酶降解细胞外基质 22。 3.2 MMPs 与牙槽骨吸收 在牙周疾病中 ,骨的破坏是十分重要的标志。但 MMPs 在牙周骨吸收中的作用还未完全阐明。当前 ,关于MMPs 的基础研究 成果为我们了解其在牙周骨吸收中的作用提供了很好的借鉴。破骨细胞的表达 ,连同组织蛋白酶 K和一些 MMPs 在骨吸收中发挥了重要的作用 23-24。 在骨吸收的过程中 ,抑制 MMPs 可以阻止细胞迁移 25-26，提示 MM
17、Ps在破骨细胞到达吸收部位的过程中发挥了重要作用，并且 MMP-9 和 MMP-14 可能是此过程中的关键蛋白酶 23,27。 MMP-14 定位于破骨细胞的细胞皱褶，可能促进破骨细胞与骨的附着及分离 ,从而与基质发生相互作用28。 除此之外， MMP 还可能通过调节破骨细胞的招募和活动从而参 与到骨吸收过程中。这些活动包括从骨基质中释放细胞因子和生长因子 (如MMP-9调节 TGF- ),调节信使与受体的结合等 23。 总的来说，骨细胞、破骨细胞不仅依赖 MMPs 对骨基质成分的直接降解，而且需要 MMPs 参与介导成骨细胞对成熟破骨细胞的活化以及破骨细胞的迁移、贴附过程。 3.3 MMPs
18、 与牙周炎症 牙龈结缔组织中的主要细胞为成纤维细胞 ,它同时也是牙周组织改建的主要修复细胞之一。成纤维细胞通过迁移、增殖、分泌胶原等对创伤修复起作用 36。正常情况下 , 牙龈成纤维细胞能合成、分泌少量有活性的胶原酶及其 它金属蛋白酶 ,产生并维持细胞外基质 ,但在炎症状况下则增加合成及分泌 MMPs 并产生纤维蛋白溶酶原激活物。将纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶 ,而活化“潜在形式”的胶原酶和其它金属蛋白酶。 基质金属蛋白酶直接参与牙周组织的破坏降解过程 ,在牙周炎的发生发展中起着重要作用。 最 近 的 研 究 显 示 明 胶 酶(MMP-2,-9)和所有的胶原酶都与牙周炎相关 29-33。
19、 Mkel 等研究显示MMP-2 和 MMP-9 可以参与到牙周炎的组织破坏中。他们在口腔中定位了不同来源的明胶酶产物，发现在牙周病中明胶酶的含量上升，并且经过治疗后，这些酶的含量明显降低。此结论在体内试验中亦得到了证明 34。通过纵向队列研究发现，胶原酶随时间而显著上升的现象只发生于牙周破坏的进程中。 4 MMPs 与牙周病的诊断 MMP-8 在牙周病中的重要作用逐 渐 为 人 们所 关 注 。在 牙 周 炎中 ,MMP-8 水平是评估疾病和判断预后的重要指标。目前 ,已有 MMP-8 的临床检查方法。它利用免疫学原理 ,通过深刮实验即可实行 ,临床牙医不需要特殊的仪器就可以在 5分钟内获得
20、结果 33,35。 MMPs 不仅是炎症进展过程中的指示因子，同样也影响着宿主反应。因而 MMPs 的水平不能单单解读为组织退化，也显示了炎症水平(保护与破坏的平衡 )。 5 MMPs 与牙周病的治疗 综上所述 ,MMPs 对牙周病的发生、发展具有一定的促进作用。因而 ,牙周病的治疗关注于研究抑制 MMPs 的活性 ,从而终止其对牙周组织的破坏作用。 金属蛋白酶抑制剂 (matrix metalloproteinase inhibitors, MMPI)是研究的重点 ,它可以分为两大类 ,分别为天然抑制剂和人工 化学合成抑制剂。在牙周病中 ,TIMP 的含量不足以通过提高 MMPs 的含量来减
21、少组织破坏，但一些研究证明通过MMPs 人工抑制剂可以控制牙周组织的破坏 38。因此人们着力于研究开发人工合成抑制剂，以期其在牙周病的治疗领域中发挥作用。目前已进入 I期临床试验的人工合成抑制剂有 Marimastat, A93340, Bayl2-9566等。有限的生物利用度和酶选择性的缺乏限制着 MMPIs 的进一步发展，未来的抑制剂将着重解决这些问题 37。 参考文献 1 Fire A, Xu S Q, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Cae
22、norhabditis elegansJ. nature, 1998, 391(6669): 806-811. 2 Grivna S T, Beyret E, Wang Z, et al. A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cellsJ. Genes & development, 2006, 20(13): 1709-1714. 3 Lau N C, Seto A G, Kim J, et al. Characterization of the piRNA complex from rat testesJ. Science S
23、ignaling, 2006, 313(5785): 363. 4 Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testesJ. Nature, 2006, 442(7099): 203-207. 5 Girard A, Sachidanandam R, Hannon G J, et al. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteinsJ. Natu
24、re, 2006, 442(7099): 199-202. 6 Watanabe T, Takeda A, Tsukiyama T, et al. Identification and characterization of two novel classes of small RNAs in the mouse germline: retrotransposon-derived siRNAs in oocytes and germline small RNAs in testesJ. Genes & development, 2006, 20(13): 1732-1743. 7 Thomso
25、n T, Lin H. The biogenesis and function PIWI proteins and piRNAs: progress and prospectJ. Annual review of cell and developmental biology, 2009, 25: 355. 8 Ro S, Park C, Song R, et al. Cloning and expression profiling of testis-expressed piRNA-like RNAsJ. Rna, 2007, 13(10): 1693-1702. 9 Siomi M C, S
26、ato K, Pezic D, et al. PIWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defenceJ. Nature reviews Molecular cell biology, 2011, 12(4): 246-258. 10 Saito K, Ishizu H, Komai M, et al. Roles for the Yb body components Armitage and Yb in primary piRNA biogenesis in DrosophilaJ. Genes & development, 20
27、10, 24(22): 2493-2498. 11 Qi H, Watanabe T, Ku H Y, et al. The Yb body, a major site for Piwi-associated RNA biogenesis and a gateway for Piwi expression and transport to the nucleus in somatic cellsJ. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(5): 3789-3797. 12 Haase A D, Fenoglio S, Muerdter F, et
28、 al. Probing the initiation and effector phases of the somatic piRNA pathway in DrosophilaJ. Genes & development, 2010, 24(22): 2499-2504. 13 Pane A, Wehr K, Schpbach T. zucchini and squash Encode Two Putative Nucleases Required for rasiRNA Production in the Drosophila GermlineJ. Developmental cell,
29、 2007, 12(6): 851-862. 14 Olivieri D, Sykora M M, Sachidanandam R, et al. An in vivo RNAi assay identifies major genetic and cellular requirements for primary piRNA biogenesis in DrosophilaJ. The EMBO journal, 2010, 29(19): 3301-3317. 15 Vagin V V, Sigova A, Li C, et al. A distinct small RNA pathway
30、 silences selfish genetic elements in the germlineJ. Science Signaling, 2006, 313(5785): 320. 16 Szakmary A, Reedy M, Qi H, et al. The Yb protein defines a novel organelle and regulates male germline stem cell self-renewal in Drosophila melanogasterJ. The Journal of cell biology, 2009, 185(4): 613-6
31、27. 17 Brennecke J, Aravin A A, Stark A, et al. Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in DrosophilaJ. Cell, 2007, 128(6): 1089-1103. 18 Gunawardane L S, Saito K, Nishida K M, et al. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5end formation in Dro
32、sophilaJ. Science, 2007, 315(5818): 1587-1590. 19 Aravin A A, Sachidanandam R, Girard A, et al. Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon controlJ. Science, 2007, 316(5825): 744-747. 20 Kawaoka S, Izumi N, Katsuma S, et al. 3 end formation of PIWI-interacting RNAs in vitr
33、oJ. Molecular cell, 2011, 43(6): 1015-1022. 21 Kandhavelu M, Kandhavelu J. pre-piRNA biogenesis mimics the pathway of miRNAJ. Biochemical Systematics and Ecology, 2012, 43: 200-204. Recent progress in the research of matrix metalloproteinases in periodontal diseases Abstract: Human periodontal disea
34、ses are important diseases in oral health. One of the important factors involved in periodontal diseases is matrix metalloproteinases (MMPs), which is responsible for collagen and extracellular matrix (ECM) degradation of the periodontal tissues. Studies have shown the significant role of MMPs and related researches are of great therapeutic importance. Keywords: matrix metalloproteinases, periodontal disease, tissue inhibitors of metalloproteinases
