1、综合性（设计性）实验 实验报告 实验名称： 人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析 姓 名： 指导教师： 专 业： 生 物 科 学 实验班级： 实验时间： 实验地点 ： 遗 传 实 验 室 成 绩： 人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析 一 实验目的 1.掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 2.掌握离心机使用、低渗处理、染色、采血技术。 3.学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。 二 实验原理 人体外周血液中小淋巴细胞，通常都在 G1 期或 G0 期，一般情况下是不分裂的。当在离体培养条件下，加入植物凝血素（ PHA），小淋巴细胞受刺激转 化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。 经
2、过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素 (PHA)则可刺激处于 G1 期或 G0 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时 间的培养，秋水仙素的处理 ，低渗和固定， 即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素可通过干扰微管组装而抑制
3、纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 体外培养的原理是将离体的细胞放入培养基中进行生长繁殖，保持细胞的生命活力，便以对细胞进行各方面的研究。体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技 术等方面。低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，
4、改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。 三实验材料 、试剂和仪器 1.实验材料：人外周血淋巴细胞 2.实验用具： 2 毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 3.试剂药品： (1) RPMI“ 1640”培养基：称取“ 1640”粉 末 10.5 克，用 1000ml 的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或 CO2气体处理，如 pH 值降至6.0 时，则可溶解而透明。每 1000ml 溶液加 NaHCO， 1.0 1.2g，以干冰或 CO2气体校正 pH 至 7.0 7.2。立即以 5号或 6号细
5、菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末 160mg(每 mg 含 126U)，用 40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每 ml 500U。高压消毒 8磅 15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体 形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素 4mg，用 100ml 生理盐水溶解，用 6 号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱 4保存。使用时用 1ml 注射器吸取该溶液 0。 05 0.1ml 加入 5ml 的培养物中，其最终浓度为 0.4 0.8ug ml。 (4) 植物凝血素 (PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取
6、 PHA 的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色 .黄色，白色的四季豆亦可。取豆子 20g，用 水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜 (4 )，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加 30ml 生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加 70ml 生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以 3000 转 min 离心 15min，取上清液，用生理盐水稀释 10 倍， 5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。 酒精乙醚提取法：四季豆 50g，
7、先用生理盐水洗净。将豆浸入 60ml 盐水中，保存于 4冰箱内， 24h 后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加 140ml 盐水，置 4冰箱中 24h，取出后以 6000 转 min 离心 20min，吸取上清液，调 pH 至 5.6(用0.1mol L HCl 调 )之后，每 100ml 上清液加 40ml 无水酒精，加以搅拌，以 3000转 min 离心 15min，取上清液，弃去沉淀。在每 100ml 上清液中加 170ml10乙醚无水酒精 (10ml 乙醚十 90ml 无水酒精 )以 3000 转 min 离心 15min，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气 2 4d，沉淀物
8、逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以 0.85 NaCl 液配成 1的溶液，此 PHA 溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每 5ml 培养物加 0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的 PHA 溶液便无需用细菌滤器过滤。 (5)抗菌素 青霉素 (以每瓶 40 万 U 为例 ): 以 4ML 生理盐水 (或培养基 )稀释，则每 ML含 10 万 U。取 1ml 加入 100ml 培养基中，则最终浓度为 100U ml。 链霉素 (以每瓶 50 万 U 为例 )：以 2ml 生理盐水 (或培养基 )稀释，则每 ml含 25 万 U。取 0.
9、4ml(含 10U)加入 1000ml 培养基中，则每 ml 含 100U(即 100g)。 (100 万 U=lg， lg=1 106 g)。 (6)姬姆萨染液： 0.5g 姬姆萨粉末，加 33ml 纯甘油，在研钵中研细，放在56恒温水浴锅中保温 90min，再加入 33ml 甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液 (pH7.4)1： 10 稀释。 (7)0.1mol L 磷酸缓冲液： pH7.4 7.6 A. Na2HPO4 12H20 28.8g KH2PO4(无水 ) 2.67g 溶解于 1000ml 双蒸水中。 B. Na2HPO4 7H20
10、2.164g NaH2PO4 2H20 0.3g 溶解于 1000ml 双蒸水中。 四 .实验方法及步骤： 1.培养液的分装： 在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为： 培养液 (RPMIl640 或 M199) 4ml 小牛血清 lml PHA 0.2ml 肝素 0.05ml 双抗 (青霉素加链霉素 )培养液中最终浓度各为 : 100U ml 用 3.5 NaHCO3调 pH到 7.2 7.4，分装到 20ml 的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于 0条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入 37恒温锅中温育 10min。 2采血：用 2ml 灭菌注射器吸取肝素 (5
11、00U ml)0.05ml 湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约 0.3ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内 (内含有生长培养基 5ml)接种，轻轻摇动几次，直立置 37 0.5恒温箱内培养。 3培养：置 37温箱内培养 66 72h。 4秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为 40 g ml的秋水仙素 0.05 0.lml，最终浓度为 0.4 0.8 g ml，置温箱中处理 2 4h。 5低渗处理：低渗液的种类较多，如 0.075mol L的 KCl 溶液， 0.95的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释 4 倍的 Hanks 液，也可直接用蒸馏水。秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取
12、出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液 5 毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中置 37温箱内处理 20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。 6离心 : 以每 1000rpm/min，离心 5min，弃去上清液，收集白细胞。 7固定：固定液 为甲醇：冰醋酸： 3： 1。每只离心管中，加入固定液 2 4ml，片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定 15min 后，离心，吸弃上清液，留下白细胞。 8再固定：加入固定液 2ml，用吸管轻轻打散，室温下继续固定 15min(过夜也可以 )。 9再离心：除去上清液，留下白细胞制片。 10制片 : 向上述离心管中滴入
13、固定液 0.5 毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液 1 3 滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干。 11染色：用磷酸缓冲液 (pH7.4)稀释后的姬 姆萨染色液染色 20min，然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。 12镜检：待稍午后，在显维镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。 13. 封片：用加拿大树胶封片。选择染色体清晰，分散度好 的细胞进行显微摄影，进行核型分析。 五实验结果及记录 : 1.核型分析：人类每个体细胞有 46 条染色体， 22 对常染色体和一对性染色体，男子是 46， XY；女子是 46， XX。
14、 2.现象如图： 3.数据计算如下：总长度： 28.4cm 上表数据中包含随体长度 六 .讨论与分析 接种的血样愈新鲜愈好 ,最好是在采血后 24小时内进行培养 ,如果不能立刻培养 ,应置于 4存放 ,避免保存时间过久 ,会影响细胞的活力 . 在培养中成败的编号 绝对长度 相对长度 短臂 长臂 臂率 着丝粒指数 随体 类型 1 2.40 8.45 1.20 1.20 1.00 50.00 无 正中着丝粒 2 2.30 8.10 0.90 1.40 1.56 39.13 无 中间着丝粒 3 2.00 7.04 1.00 1.00 1.00 50.00 无 正中着丝粒 4 1.80 6.34 0.
15、60 1.20 2.00 33.33 无 亚中部着丝粒 5 1.70 5.99 0.50 1.20 2.40 29.41 无 亚中部着丝粒 6 1.50 5.28 0.50 1.00 2.00 33.33 无 亚中部着丝粒 7 1.40 4.93 0.50 0.90 1.80 35.71 无 亚中部着丝粒 8 1.30 4.58 0.40 0.90 2.25 30.77 无 亚中部着丝粒 9 1.20 4.23 0.50 0.70 1.40 41.67 无 中间着丝粒 10 1.20 4.23 0.40 0.80 2.00 33.33 无 亚中部着丝粒 11 1.20 4.23 0.20 1.
16、00 5.00 16.67 无 亚端部着丝粒 12 1.10 3.87 0.30 0.80 2.67 27.27 无 亚中部着丝粒 13 1.00 3.52 0.20 0.80 4.00 20.00 无 亚端部着丝粒 14 0.90 3.17 0.20 0.70 3.50 22.22 无 亚端部着丝粒 15 0.90 3.17 0.10 0.80 8.00 11.11 无 端部着丝粒 16 0.90 3.17 0.35 0.55 1.57 38.89 有 中间着丝粒 17 0.80 2.82 0.25 0.55 2.20 31.25 无 亚中部着丝粒 18 0.80 2.82 0.20 0.6
17、0 3.00 25.00 无 亚端 部着丝粒 19 0.70 2.46 0.30 0.40 1.33 42.86 无 中间着丝粒 20 0.60 2.11 0.30 0.30 1.00 50.00 无 正中着丝粒 21 0.60 2.11 0.30 0.30 1.00 50.00 无 正中着丝粒 22 0.40 1.41 0.15 0.30 3.00 25.00 无 端着丝粒 x 1.20 4.23 0.40 0.80 2.00 33.33 无 亚中部着丝粒 y 0.50 1.76 0.10 0.40 4.00 20.00 无 亚 中部着丝粒 关键 ,除了至为重要的 PHA 的效价外 ,培养的
18、温度和培养液的酸碱度也十分重要 .人的外周血淋巴细胞培养最适温度为 37 0.5 .培养液的最适 pH7.2 7.4. 制片过程中 ,如发现细胞膨胀得不大 ,细胞膜没有破裂 ,染色体聚集一团伸展不开 ,可将固定时间延长数小时或过夜。 七 .参考文献 1 司徒镇强，吴军正细胞培养 M世界图书出版公司， 1996： 62 69 2 王亚馥，戴灼华遗传学北京：高等教育出版社， 1999 3 Pene J,et al.J Immunol 1988;141:1218 4 丁显平 ,董芳 ,卢光涛 ,周明学 ; 细胞培养及染色体诊断技术质量控制 J;重庆医学 ; 1994年 01 期 5 肖正华 ; 改良的与染色体标本的制作技术 J 人体外周血淋巴细胞的培养 ; 第三军医大学学报 ; 1994 年 06 期 ; 450 6 Hazum E,Chang KJ,Guatracasas P. Specific nonopiate receptors for -endorphins. Science,1979;205(6):1 033 1 035 7 刘祖洞，江绍慧遗传学实验（第二版）北京：高等教育出版社， 1987 8 孙勇如遗传学手册长沙：湖南科学技术出版社， 1989
