1、1 神经胶质瘤的研究意义 神经胶质瘤（ Glioma）是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的 50%左右。目前临床上 IV 型神经胶质瘤是恶性程度最高的脑部肿瘤，至今无法治愈 1。多形性胶质母细胞瘤（ Glioblastoma Multiforme, GBM） 起源于脑部神经胶质细胞，成年脑癌患者中约 80%为浸润性的星形细胞瘤。由于该肿瘤是 浸润性生长 物，其和正常 脑组织 没有明显的界限，因此难以被完全切除或根本不能手术。血脑屏障的存在，又使得 化学药物 和一般抗肿瘤的中药 难以发挥疗效。该肿瘤细胞对放疗亦不甚敏感，非常容易复发。因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。据文献报道
2、神经胶质瘤的中位生存时间和无进展生存时间分别为 14.6个月和 6.9个月， 5年生存率为 9.8%2。近年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率达到每 100,000 人口中有 5.26个人，而且每年有 17000 人被最新诊断出患有该致死性疾病 3,4。因此， 积极研究神经胶质瘤的发病原因、寻找恶性胶质瘤治疗切实有效的治疗手段已成为目前亟待解决的关键问题。 2 上皮 -间质转化与 神 经 胶质瘤发生发展的 关系 人脑胶质瘤发生、发展过程中，多种癌基因、抑癌基因的异常改变牵涉其中。肿瘤的形成和发展与基因改变间的关系是近年来肿瘤学研究的核心问题之一。多种基因的改变都参与到肿瘤细胞生长过程
3、中，肿瘤细胞生长是肿瘤最基本的生物学行为，生长异常是肿瘤恶性行为的基础。大量的研究证实，肿瘤的形成起源于单个获得了癌基因和（或）抑癌基因改变的细胞；肿瘤的发展（包括由分化较好的肿瘤转变成分化差的肿瘤，局部浸润和远处转移）则是更多癌基因和抑癌基因受累后作用叠加，肿瘤细胞克隆选择和扩增的最终结果 5。 在胶质瘤发生发展的大量研究中，人端粒酶逆转录酶（ hTERT）6、内皮生长因子受体（ EGFR） 7、热休克蛋白（ HSP） 8等分子以及 PKA、 PKC、 ERK9, 10等关键信号转导分子均在神经胶质瘤的发生发展过程中发挥重要作用。 p53 基因的失活 11和血小板源生长因子（ PDGF）与其
4、受体的激活 12是神经胶质瘤非常常见的两个基因改变。P53基因突变在胶质瘤的各个分期中都起到关键作用，据报道在 25-30%的原发性胶质瘤和 60-70%的继发性胶质瘤中都发现 p53基因的改变。p53下游信号（如 MDM2, MDM4, INK4/ARF）在胶质瘤的发展过程中也都起到关键作用 11。 3. Zeb1 与神经胶质瘤 Zeb1 是胚胎发育过程中必须的转录因子 13，在胚胎形成及发育中的作用其突变能引起胚胎严重畸形。 ZEB1 是软骨形成的修饰基因，可抑制 1型和 2型胶原的表达，并在在胸腺 T细胞发育中起主导作用 ，同时 Zeb1也抑制 IL-2 的转录活性 14， 成体 突变
5、Zeb1 可引起 角膜营养不良 15， 研究发现 Zeb 基因 也 能够抑制抑癌基因的表达，可抑制 p63和肿瘤抑制基因臂板蛋白 3F (semaphorin 3F， SEMA3F)的表达，而且视网膜母细胞瘤抑制蛋白 (Retinoblastoma， Rb)缺失或 p53蛋白表达的缺失或者 p53 突变体表达增加均可以诱导 Zeb1 的表达，说明Zeb1 基因能够抑制肿瘤细胞的生长和癌症的发展 16。 Zeb1 是基膜(Basement Membrane， BM)的主要调节物，它可促使肿瘤的间质浸润17。 Zeb1染色程度与子宫内膜癌侵袭性表型相关，侵袭性 II 型子宫内膜癌间质细胞及上皮源性
6、肿瘤细胞 Zeb1 表达明显升高。在乳腺癌和结直肠癌侵犯的组织中瘤细胞及肿瘤间质均可检测到 Zeb1 表达，并且 Zeb1可通过与 E-钙黏蛋白上保守的 E2-boxes结合使其转录下调，导致 EMT，诱导肿瘤侵袭。在肺癌和胃癌中， Zeb1通过调节降低 E-钙黏蛋白的表达导致肿瘤分化降低，侵袭性及转移能力增强 18-21。 Zeb1 信号通路在胶质母细胞瘤的发生发展，侵袭及耐 药等方面均有十分重要的作用， Siebzehnrubl等研究发现 Zeb1在侵袭能力强的胶质母细胞瘤中高表达，目前可以通过检测患者 Zeb1表达作为预测短期生存率和治疗反应好坏的临床指标，而且 Zeb1被认做是胶质母细
7、胞瘤复发的重要候选分子，浸润性肿瘤细胞的标记和重要的潜在治疗靶点 22。但是，关于 Zeb1 参与胶质母细胞瘤致 病过程的具体调节作用机制目前还不十分明了，仍需大量研究揭示验证其在恶性胶质瘤细胞生长和侵袭过程中上下游重要调控分子和信号网络 。 我们前期实验发现过表达 PDGF-A 能够明显促进小鼠脑内神经胶质瘤的形成；加入外源性 PDGF-A能够促进胶质瘤细胞生长发生 EMT 并上调 Zeb1、 Vimentin 的表达，下调 E-cadherin 的表达，抑制 Zeb1后能抑制细胞生长，相反， Zeb1过表达能促进细胞的生长和迁移，提示 PDGFA可能通过 Zeb1调节胶质瘤细胞 EMT过程
8、 （ 预实验 3）。并且过表达 microRNA-200b-c（生理状态下， mRNA-200 家族作为 zeb1 拮抗分子） 后可逆转 PDGF-A 对 Zeb1 表达和细胞生长迁移的促进作用 （ 预实验 10）。提示 Zeb1可能在由 PDGFR介导的神经胶质瘤中起重要的调节作用， microRNA-200b-c 可能参与该过程中。因此，基于已有研究结果，我们 拟从分子、细胞、动物模型、临床样本等不同层次深入研究 Zeb1 在神经胶质瘤细胞生长和肿瘤侵袭中的作用，并阐明其分子调控机制，为神经胶质瘤的诊断和治疗提供新的分子靶标。 3 ZEB1 在 PDGFR 调节肿瘤 瘤生长与侵袭中的 作用
9、 血小板源 衍生生长因子（ PDGF）是可以由多种细胞产生的多肽，具有刺激平滑肌细胞、胶质等细胞增生等广泛的生理活性。 PDGF 是由 A、 B两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体。传统的 PDGF 包括三种形式 :PDGF-AA、 PDGF-BB、 PDGF-AB。近年来还发现了 PDGF 家族的另两种形式 :PDGF-C 和 PDGF-D23。血小板衍生生长因子受体（ PDGFR）异常表达和激活是胶质瘤发生发展的主要分子机制之一 24。在恶性胶质瘤临床样本的 11 个扩增基因中，PDGFR 排在第三位 12，提示 PDGFR 在神经胶质瘤发生发展过程中的关键作用。 另据报道神经胶
10、质瘤病例中约 30%的人与 PDGFR 的表达相关 25，约 40% PDGFRA 高表达的病例中存在 PDGFRA 8,9这一突变体，它外显子 8和 9中的 243 个碱基缺失，可以导致其激活26。另外，还有文献报道称 PDGFR 过表达及受体上的多个下游调控位点均与神经胶质瘤的恶性程度和很差的预后直接相关，也是胶质瘤病人生存时 间变短的主要因素 12。但是 PDGFR在胶质瘤生长侵袭过程中的具体机制、参与 PDGFR调控胶质瘤生长侵 袭的下游信号通路和关键分子、以及相关信号调控网络等重大科学问题仍需进一步研究 。 本课题组前期 发表 在 J Clinical Investigation12
11、和 Oncogene27上 研究表明， PDGFR及其下游信号分子参与 调控 神经胶质瘤 的增值和侵袭。 PDGFR活化后，主要激活 PI3K 和 MAPK 途 径。PI3K（磷脂酰肌醇 3-激酶）途径能够活化蛋白激酶 B （ PKB，Akt），该途径在一系列 广 谱的人类肿瘤中都可以被激活，其在恶性胶质瘤中，也同样起到重要作用，可通过激活 CD133 和 p85 位点的相互作用激活 PI3K/Akt 途径促使胶质瘤干细胞的肿瘤原性28。 肿瘤细胞侵袭是恶性胶质瘤发展过程中最重要的特征，及其下游关键信号分子都在神经胶质瘤侵袭过程的信号转导过 程中扮演重要角色； 而上皮 -间充质转化 (Epit
12、helial-Mesenchymal Transition， EMT)过程是肿瘤侵袭的重要步骤， E盒结合同源盒蛋白，即 Zeb1是上皮 -间充质转化的诱导因素之一 29。 我们发现 在神经胶质瘤细胞系中存在 PDGFR和 Zeb1共高表达的现象（ 预实验 2），因此，探讨 PDGFR和 Zeb1是否存在调控关系以及其中可能的调控网络很可能成为解决神经胶质瘤细胞通过 EMT 过程发生侵袭的症结所在 。 4 Zeb1 蛋白分子的修饰和胶质瘤的关系 Zeb1具有 6 个功能结构域：包含两个 C2H2的锌指 ZFD结构域，是 DNA结合部位，结合到相关基因的 Z盒和 E 盒 30；中央部分有一个 P
13、OU样的 HD结构域；同时含有一个结合到 R-Smads的 SBD结构域和结合 CtBP 蛋白的 CID 结构域 31；最后还包含一个结合共激活因子 P300 和 P/CAF 的 CBD 结构域（图 1）。正常情况下， Zeb1 会有泛素化修饰， 影响其转录抑制活性 32，而 Zeb1和 CtBP1、 HDAC1 的直接结合介导了这种转录抑制 33, 34。 Zeb1蛋白分子存在多个潜在的能 丝氨酸磷酸化 的位点 35， 但迄今为止 Zeb1 的修饰和其功能的关系，尤其在胶质瘤中的作用，很少有报道，我们在 预实验 5 中发现，胶质瘤中 Zeb1 存在一定的 丝氨酸 磷酸化修饰 ， 这提示我们
14、磷酸化可能参 与了 Zeb1 的功能调节，因此探讨 Zeb1 修饰作为调节 PDGFR 调控网络 的因素之一，有助于清晰阐明神经胶质瘤发生发展过程中的内在原因。 图 1： Zeb1 蛋白 结构简图 总之，在前期研究的基础上， 本项目将借助体外实验与体内动物模型以及恶性胶质瘤的临床样本，利用分子生物学及细胞生物学等的研究方法，探讨 Zeb1 介导 调节的神经胶质瘤生长与侵袭作用及分子机制，深入探索其中可能的调控网络，从而确定 Zeb1 是否有可能成为一个新的神经胶质瘤的治疗靶点。 本课题的目的在于希望通过该研究不仅可以补充 PDGFR 调控神经胶质瘤侵袭作用的机制，加深对 PDGFR调节肿瘤发生
15、与侵袭的作用的理解，还望找到新的治疗神经胶质瘤的靶向位点，如 Zeb1， 为建立新型的联合基因靶向治疗该致死性疾病提供理论基础。 因此，该项目的研究具有重要的理论和临床意义。 参考文献 1. Tanaka, S., et al., Diagnostic and therapeutic avenues for glioblastoma: no longer a dead end? Nat Rev Clin Oncol, 2013. 10(1): p. 14-26. 2. Stupp, R., et al., Effects of radiotherapy with concomitant and
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