1、目 录 一、设计目的和要求 .1（一）. 设计目的 .1（二）. 设计要求 .1二、总体方案的拟定 .2（一）. 实验原理 .2（二）. 技术路线 .3三、原料选取说明 .4四、实验仪器的确定 .4五、实验试剂的选择及制备方法 .5六、实验过程设计 .6（一）. 实验步骤 .6（二）. 操作要点 .7（三）. 注意事项 .7七、设计心得 .8八、参考资料 .9细胞工程课程设计1一、设计目的和要求（一）. 设计目的（1）通过直接消化法分离小鼠干细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞，进行相关实验研究。（2）进一步掌握和熟练动物细胞培养的基本内容，了解细胞培养的特点和步骤。（二）. 设计要
2、求通过设计实验，掌握动物细胞的增殖，用消化法进行小鼠肝细胞的培养实验。通过选取小鼠和培养基配方以及分离小鼠肝细胞，掌握配制培养液及操作具体步骤的实验设计技能；基本掌握动物组织、动物细胞培养中形态发生和建成的途径；掌握动物细胞培养中对温度、pH 值、等各种条件的要求与技术。 在本设计性实验项目过程中，掌握快速查阅专业文献资料的能力，根据培养目的选定合适的材料，拟定培养方法，设计培养基配方；掌握无菌操作方法，找到防止污染的措施及对污染原因的分析；培养在实验过程中发现问题、分析问题、解决问题的能力；培养团队协作及与实验指导教师交流、合作的能力；为从事生物细胞学领域的相关研究及与细胞工程有关的生物技术
3、奠定良好的技术基础和实验能力。细胞工程课程设计2二、总体方案的拟定（一）. 实验原理原理：采用胰蛋白酶消化法。常用的胰蛋白酶的浓度的 pH7.2 左右，一旦细胞分散后可加入一些含血清的培养液来终止消化，胰蛋白酶是目前最广泛使用的消化剂。适于细胞间质较少的软组织及传代细胞的消化，但对于纤维性组织，或较硬的癌组织，则效果较差。最适温度为：37。消化时间依据不同情况而定，温度低、组织块大、胰蛋白酶低者，消化时间长；反之，则相应减少时间。25%的胰蛋白酶浓度在 37下消化 5cm3大小的胚胎类软组织，需要 20-30 分钟。酶浓度过大或消化时间过长，细胞可被消化掉；但消化不充分也达不到细胞分散的目的。
4、使用胰蛋白酶时可改变不同参数以确定出最佳消化效果。有些组织和细胞对胰蛋白酶的耐受性差，因而，要分次消化，并及时把已消化下来的细胞与组织分开放入含有血清的培养液中，分散后继续消化。Ca 2+Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的抑制作用，故不用加含这些离子的溶液。细胞工程课程设计3（二）. 技术路线消毒拉颈法处死小鼠逐层消毒解剖取肝清洗剪碎组织约 1 立方毫米洗涤镜检过滤离心洗涤加 5%血清的 D-Hanks 液终止消化不时吹打振荡加胰酶消化 30min细胞工程课程设计4(1）实验准备阶段清洗：新玻璃器皿用自来水刷洗，再侵泡 5%HCL 中和碱性物质和其他有害物质，使用过的玻璃器皿,侵入清水中避免干涸
5、难洗，用洗涤剂清洗，倒置干燥，侵酸性洗液过夜，捞出用自来水清洗，烘干，用纸包装。高压蒸汽灭菌，储存备用。胶塞处理：用清水清洗，再用 0.2%NaOH 煮沸 1020min,自来水清洗 10次，用 1%Hcl 侵泡 30min，自来水清洗 10 次，蒸馏水刷洗 3 次晾干，高压灭菌。旧的胶塞直接用洗涤剂煮沸清洗，晾干，包装，高压灭菌。消毒：物理消毒 1）紫外线消毒：用于消毒空气，操作台和不能用干湿热灭菌的培养器皿。2）干热灭菌：用于玻璃器皿的灭菌，将用器皿放在干燥箱加热至160c,保温 90-120min 3）湿热灭菌：高压蒸汽灭菌，是最有效的灭菌方法，用于布类，橡胶制品，金属器械，玻璃器皿，某
6、些塑料制品及加热后不产生沉淀的无机溶液。4 滤过除菌：用于培养液和各种不能高压蒸汽灭菌的溶液，采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上合适的滤膜。化学消毒：1）70%或 75%酒精，用于一些金属器械，台面的消毒 2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂及台面的消毒。3）来苏尔水：用于无菌室桌椅，墙壁，地面的消毒。4）0.5%过氧乙酸：10min 可将芽孢杀死，用于物品的表面消毒，用喷洒和擦拭的方法。注意事项：1.清洗玻璃制品时，侵酸之后一定要用清水冲洗 10-15 次，残留液体对细胞粘附有极大影响，清洗塑料制品时用棉花或揉软纱布，千万不要用硬毛刷，以免损坏表面。试管用超声清洗处理后逐个清洗，没有洗净会
7、有影响。2.干热灭菌，应在白天用烘箱，避免发生意外，当温度超过 100c 时不能打开烘箱门。金属制品，橡胶，塑料制品不用此法。3.高压蒸汽灭菌后，器皿务必晾干，烘干，以免发霉4.牛血清，大部分培养基，胰酶和一些生物制剂是有机溶剂，不用高压蒸汽法灭5.过滤灭菌时，过滤器使用前包好过滤膜，高压灭菌后才可使用，过滤酶制剂时将温度降到室温下，压力不宜过大，过大会使过滤膜破裂，过滤膜包装时，螺丝不宜过紧，以防蒸汽不能进入，灭菌后拧紧使用。6.化学消毒时，配制 75%酒精用卫生级，来苏尔水不能消毒皮肤细胞工程课程设计5四、实验仪器的确定超净工作台、CO 保温箱、显微镜、水浴箱、离心机、离心管高压灭菌锅、电
8、2热干燥箱、酒精灯、纱布、解剖剪、解剖镊、培养瓶、培养皿、研磨玻片、滤网、6 孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器，酒精棉球,废液缸, 镊子,火柴,喷壶。血细胞计数板、盖片、滴管或移液器、枪头。五、实验试剂的选择及制备方法1.75%乙醇 (99.7%*V=75%*100)2. RPIM1640 培养液（小牛血清和青霉素、链霉素）关于 RPMI 1640 细胞培养液的配制 1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节 pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移
9、培养基液体的器具都应进行灭菌）。3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量 1/3 的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入 NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等其他试剂。细胞工程课程设计65) 加抗生素：一般抗生素终浓度为青霉素 100U/ml，链霉素 100U/ml。市售青霉素为80 万 U瓶，可溶于 4ml 体积，每一升培养液中加 0.5ml 即可。市售链霉素为 100 万 U瓶，可溶于 5ml 体积，每一升培养液中也加 0.5ml 即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为
10、50200U/ml。6) 调 pH 值：加水到 900ml（在需要加 10小牛血清的情况下），然后用 5 NaHCO3 调节 pH 到 7.2。7) 过滤除菌：宜采用 0.45um 和 0.22um 滤膜各一张，上层为 0.45um，下层为 0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100 或 200ml）。8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（20）。临用前将加入小牛血清(10%20%)。【注意事项】每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液， PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。市售小牛血清使用前多应该
11、灭活（56，30min），以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量 3.54.5g/100ml，球蛋白不高于2g100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。由于市售小牛血清 pH 未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的 pH 可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调 pH 值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于 37温箱内置 2448hr，以检测培养液是否有污染。每次配液量以两周左右
12、为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，造成实验繁琐或者污染。3.0.25%胰酶一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g 胰酶步骤：1 先配 100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa212H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K 溶于 1000ml 蒸馏水)2 称胰酶 0.25g3 加入 PBS 中，低速搅拌 4h 冰浴中,或者 4过夜低速搅拌 0.5h 冰浴中4 调 PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20保存，4短期内用完tip:低速很重要，机
13、械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入 0.02g 的 EDTA(0.02%)tip:因为 EDTA 可以络合 Ca2 ，增加消化效力4D-Hanks 液及配制NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na 2HPO4H2O 0.06g，KH 2PO4 0.06g，NaHCO 3 0.35，酚红 0.02g，加入双蒸水 1000ml 溶解调 PH 值 6.8-7.0，分装在 250ml 输液瓶中，细胞工程课程设计7高压消毒，冷却后放于 4 度冰箱中保存备用。注意：酚红对细胞有一定毒性，目前实验中的用量除 0.02 克外，还有 0.01 克和0
14、.005 克，也有 BSS 液中不加酚红的。酚红量不同，BSS 颜色也不同。5DMEM 培养液取 1000ml 消毒过的锥形瓶，注入一定量的消毒过的双蒸水，首先加 DMEM 培养基，溶解后，再加 3.7g 碳酸氢钠，定容后调 PH 值 6.8-7.0，在无菌台上抽滤除菌，并分装至 100ml 输液瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，放在冰箱中 4 度保存备用。6 .0.4%台盼蓝染液称取 4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100 毫升，用滤纸过滤4c 保存。使用液：使用时，用 PBS 稀释母液至 0.4即可。三、原料选取说明选取 24 周龄小鼠的肝细胞为实验所用，雌雄不限。6、实验过程设
15、计（二）. 实验步骤1.将小鼠引颈处死后于含有 75%酒精中的大烧杯中浸洗 10 秒钟，沥干。细胞工程课程设计82.用剪刀剪开小鼠腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打开腹腔,迅速取出肝脏。将其放入装有 4的含双抗的.D-hanks 液中进行漂洗 2 次，如此反复 3 次，最后一次清洗后，将试管放入离心机 800rp/min 离心 4min。3.将离心后的试管取出后弃上清液，加入 5-6 倍肝组织体积的含 0.25%胰酶和EDTA 于 37 消 化 细胞 40 min。 消化完全者可用吸管吹打散开。4.将消化完全的悬液经 200 目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个 5ml 离心管中
16、，之后向过滤后的悬液中加入含 10%新生牛血清的DMEM 培养基到 5ml，于 4冰箱中静置 20min。 5.用吸管弃除悬液，加入 DMEM 培养基至 5ml，以 1000rp/min 离心 4min，弃上清液，如此反复 3 次。6.最后离心完后加入 2ml 含 10%新生牛血清的 DMEM 完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中，进行台盼蓝活细胞计数。7.最后加入相同的完全培养基，调整细胞密度至 5105/ml，于 37 5%CO 条2件下培养。8.10h 后首次换液，换以含 50ml/L 的新生牛血清的 DMEM 培养液。细胞纯化细胞纯化采用酶消化法与机械刮除法相结合的方法，集体操作：酶消化法
17、：1）先用 0.5%胰蛋白酶和 0.02 %的 EDTA（1:1 ）混合液漂洗培养细胞，让后再换新的混合液继续消化，之后再倒置显微镜下观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来以后，便立即停止消化。2）把消化液吸入离心管中，离心上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液置温箱中培养，再向原瓶内也补加新的培养液继续纯化。经过几次反复处理，可把纤维细胞除净。机械刮除法：1）标记 镜下观察，用记号笔在培养瓶的背面圈下上皮细胞生长部位。2）刮除 弃掉培养液，把无菌胶刮刀伸入瓶中，肉眼或显微镜下，刮除无标记空间。3）冲洗 用 Hanks 冲洗液冲洗 1 或 2 次，洗除被刮掉的细胞。细胞工程课程设计94）培养
18、 然后注入培养液继续培养，发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除刮除至完全除掉为止。细胞冷冻：将对数期的细胞以等体 20%DMOS 培养液重悬，并分装于冷冻管中，降温至 4C 30 min ，冰盒 10 min 液氮罐气相 2h ，最后投入液氮中保存。冻存细胞的复苏：取出储存细胞，37C 水浴中快速融化，移入完全培养基中进行活细胞计数，细胞接种密度为 3105 个/ml，培养 12-24h 更新新鲜的完全生长培养基，以去除冻存剂。传代培养操作步骤倒出旧培养液，用 pbs 洗涤 2 次从无细胞面加入消化液，使消化液侵没细胞层倒置显微镜下观察细胞的变化，当细胞收缩变圆时取回细胞，将消化液倒出。加入生长
19、液后用吸管吹打数次，使细胞分散。计数调整细胞密度（2*10-5).封装，培养细胞计数细胞计数原理细胞密度（个/ml ）=n/4 1000稀释倍数 n=四大格内的细胞总数 （2）台盼蓝染色原理台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。（3） 四 实验内容死活细胞鉴别 细胞计数及活细胞百分率计算 1. 血细胞计数板及盖片备好； 2. 9 滴细胞悬液+1 滴台盼蓝，混匀，置 2-3min; 3. 悬液滴至计数板和盖片空隙中； 4. 计数。五、注意事项： 1. 细胞悬液应充分混匀； 2. 吹打混匀细胞时不要产生气泡； 3. 计数中，不要漏记，不要重复，每个细胞悬液至少滴样两次求平均值；4. 细胞计数板不可放干，需用完即冲。 （二）. 操作要点1.接种工作需要在超净工作台内进行。接种前，用 75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。在操作过程中，为防止污染，每一步都需要在酒精灯附近进行。将肝细胞植入培养瓶前，要将瓶口用酒精灯稍烘烤一下。盖上盖前，也应在酒精灯上烘烤一下，防止污染。
