1、11433 蛋白在植物碳氮代谢中的作用摘 要：14-3-3 蛋白是一种重要的信号转导调节分子，通过与磷酸化的目标靶蛋白相结合，调节植物的一系列生命活动过程，包括生长发育、糖代谢、氮素的吸收和利用等。概述了 14-3-3 蛋白的结构、种类、分布，并重点介绍了 14-3-3 蛋白在植物碳氮代谢中的作用，同时提出研究 14-3-3 蛋白的功能、探讨其在植物糖代谢中的调控机制，对今后农作物品质改良具有重要意义。 关键词：14-3-3 蛋白；结构；种类；分布；碳氮代谢 14-3-3 蛋白最早由 Moore B 和 Perez V 于 1967 年在哺乳动物脑部酸性可溶性蛋白中发现，并根据其在 DEAE
2、纤维素层析中的片段数与淀粉凝胶电泳中的位置命名1。其后约 20 a 时间里，人们普遍认为 14-3-3 蛋白仅仅存在于动物脑部，与神经元的功能有关24。但是近期的研究表明，14-3-3 蛋白存在于所有调查过的真核生物的所有器官和组织中3，含有 14-3-3 蛋白的组织数目之大，说明其功能涉及到许多生命活动过程2；而在所有调查过的原核生物中都不存在。 14-3-3 蛋白是蛋白质与蛋白质质检相互作用的“桥梁” ，能与多种蛋白质相互作用，几乎参与生命体的所有生理反应过程。近年来越来越多的研究者对其在植物糖代谢中的调控作用开展了深入研究。本文根据近年来的研究进展，就 14-3-3 蛋白在植物糖代谢的作
3、用加以介绍，为进一步研究 14-3-3 蛋白在生产实践中的应用研究提供理论依据。 21 14-3-3 蛋白的结构 14-3-3 蛋白中心区域高度保守，绝大多数变异发生于 N 和 C 端。事实上，N 端氨基酸的保守性仅 14%，而 C 端氨基酸仅有极小的保守性3。2 14-3-3 蛋白的种类 3 14-3-3 蛋白在植物体内的表达与分布 3.1 14-3-3 蛋白在植物体器官中的表达与分布 14-3-3 蛋白广泛分布于植物的各个器官和组织。Wilczynski 等的研究表明，14-3-3 蛋白在植物体内的分布具有器官组织特异性，其表达受到发育阶段的调节。该结论得到后续研究的支持，同时 Weste
4、rn blot 还表明马铃薯叶片中 14-3-3mRNA 的总含量随着叶片的衰老而减少10。Szopa9利用 Northern blot 分析马铃薯中已知的 6 种 14-3-3 蛋白同工型在各个不同器官组织内的分布情况，显然，各同工型在不同的器官中表达量不同，同一器官中不同的同工型之间表达量存在很大的差异。分析各同工型在沿茎的相邻叶片中的分布可以发现：除 35g 外，14-3-3 蛋白的各同工型在叶片中的含量从生理上端到生理下端（随叶片生理年龄的增加）呈一定的梯度分布，说明 14-3-3 蛋白的表达可能受到所在组织的生理年龄的调控9，12，荧光蛋白标记检测也证明了上述结论13。 14-3-3
5、 蛋白表达的组织特异性是其启动子序列特征的反映。对马铃薯 14-3-3 蛋白同工型 16R 的假定启动子区的分析表明，多数功能区域都能被 Dof 蛋白、E/ABRE-like Box 识别9。有研究表明，Dof 蛋白在体内作为转录起始区域13；而在 -菜豆素基因启动子中，E-box 定位于3不同位点对基因表达起到协同调控的作用14；AGAAA 序列在番茄花粉中随发育进程调节 late 52 基因的表达15；-300 element 被证明是大麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白基因的增强子元件，转录因子 Jun 和GCN4 与该功能域结合16；ARE 结合位点的存在使得 16R 启动子受到生长素
6、IAA 的强烈诱导；而 GATA Box、I-Box 和 GT1 box 与高度的光调控和组织表达特异性有关，后者可以稳定 TFIIA-TBP-DNA 复合体，SEF4 结合位点的存在暗示这 3 种元件构成一个增强子发挥作用9，类似于大豆基因编码存储蛋白时的情况17；14-3-3 蛋白的高表达可能与 SAR/MAR序列有关18，该序列与染色质同核基质的结合有关，而与核结构结合的基因都是高度活化的；蔗糖调节基因中的保守序列 AATAGAAAA 可能对于启动子的活化很重要，因为有结果表明 14-3-3 蛋白同工型 16R 基因受蔗糖含量或是蔗糖代谢产物的控制，14-3-3 蛋白的活性可能与韧皮部的
7、装载有关9。 3.2 14-3-3 蛋白在植物细胞内的分布 14-3-3 蛋白广泛分布在细胞内，这与它作为各种成分参与到多种蛋白质间的相互作用的观点相符合，但是，某些特殊的亚细胞定位表明某些同工型具有特化的组分。利用同工型特异的抗体及 14-3-3 蛋白与绿色荧光蛋白融合获得了拟南芥中 8 类同工型的亚细胞定位，表明特定的同工型有特异的细胞内定位，同时，拟南芥的 5 条染色体上都至少有 1 种14-3-3 蛋白同工型分布2。在转基因拟南芥中，通过羧基端融合绿色荧光蛋白对同工型 和 的定位研究表明，同工型 趋向于定位在原生质膜，而同工型 则趋向于定位在细胞质中19。通过免疫显微技术对4细胞核内容
8、物的检测发现，细胞核内至少分布有 5 类 14-3-3 蛋白同工型20。同工型 和 在淀粉颗粒中有分布21。 4 14-3-3 蛋白在植物糖代谢中的作用 Sehnke 等21通过在拟南芥中反义抑制 14-3-3 蛋白同工型 GF14和 GF14，发现与野生型比较，反义植株叶片中淀粉总含量增加近 2 倍，可萃取的淀粉含量提高近 4 倍，碘染后淀粉颗粒中碘-淀粉复合体的吸收光谱表明，反义植株来源的碘-淀粉复合体吸收光谱较野生型来源的向蓝光波长移动，说明反义植株中支链淀粉含量增加，对两种来源的淀粉的可糊化程度的分析也支持了这一论断。经测定，在反义植株中淀粉的降解速度为 1.31.5 mg?g-1?h
9、-1，而在野生型中淀粉降解速度约为 1 mg?g-1?h-1（湿重） ，说明前者的淀粉降解途径完全启动，而负调控的减少时其淀粉含量的增加，进一步说明 14-3-3 蛋白在淀粉代谢中起抑制作用，通常关闭淀粉的合成21。 体外试验结果表明，SPS 的活性在很大程度上受到 14-3-3 蛋白的控制7，12。在 Szopa J 等11的试验中，通过反义抑制考察了马铃薯 14-3-3 蛋白同工型 20r 和 29g 在糖代谢中的作用，结果表明，叶片中焦磷酸蔗糖合成酶 SPS 的活性在所有转基因植株中都显著升高，但是蔗糖含量并没有相应的上升，推测可能是由于增加的蔗糖迅速地被用于多种代谢途径中碳骨架的合成。
10、在另一个试验中，结果有所差异，在 SPS 活性最高的系列中蔗糖含量比对照增加了近 4 倍，而其余的转基因植株中蔗糖含量与对照差异不大，分析认为，14-3-3 蛋白的总量对酶的活性的控制作用比单独某一个同工型的作用更加重要12。何天久等22研究发现，在转 Sb14-3-3 干涉载体马铃薯块5茎贮藏过程中，还原糖积累速率随目的基因表达量的降低而减慢，与该过程伴随发生的是蔗糖积累的同时减慢，推测 Sb14-3-3 可能参与马铃薯块茎低温糖化调节途径。 Szopa 等9，11的试验中还观察到 -酮戊二酸含量的上升，以及与之相关联的谷氨酸/焦磷酸谷氨酸含量的增加，同时葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、柠檬酸、苹
11、果酸的含量都显著上升，表明在反义植株中糖酵解与 TCA 循环之间生化途径的活化。 通过对参与 TCA 循环的各种酶在反义抑制 20r 和 29g 马铃薯植株中活性检测发现，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 PEPcase 和柠檬酸合成酶的活性显著上升，而丙酮酸激酶的活性上升并不显著，检测还发现马铃薯块茎中天冬氨酸/天冬酰胺和谷氨酸-焦谷氨酸/谷氨酰胺的含量上升，可能是由于柠檬酸和苹果酸含量上升对下游代谢的刺激造成的7。 马铃薯块茎中，SPS 的活性在反义抑制 20r 和 29g 的植株中也显著上升，而当反义抑制 20r 或者同时抑制 20r 和 29g 时，葡萄糖和淀粉的含量增加，而焦磷酸葡萄糖和果糖的
12、含量在分别抑制 20r 和 29g 时并不受影响，在同时抑制两者时下降，说明 14-3-3 蛋白对叶片和块茎中 SPS 的活化途径不同。 在反义抑制 14-3-3 蛋白的植株中，块茎、叶片中淀粉含量普遍升高7，11，12，21 ，因此推测淀粉合成的关键酶 SuSy 活性受到 14-3-3蛋白的的调控，但是检测结果表明，块茎中 SuSy 活性仅有极小幅度的上升，同时体外试验也说明 14-3-3 蛋白对 SuSy 活性没有影响，另外两个糖代谢中的重要酶 AGPase 和 UGPase 的活性也没有受到影响，因此，块6茎中淀粉含量的上升可能是由于 SPS 的活性升高所致12。 免疫电镜技术检测表明，
13、野生型拟南芥叶绿体淀粉颗粒密布有非 类的 14-3-3 蛋白同工型，而 类的 14-3-3 蛋白同工型分布较为稀少，说明除同工型 和 外，非 类的 14-3-3 蛋白可能与淀粉合成有关（尚无相关的数据可以证明） ，这些同工型之间的关系以及 14-3-3 蛋白活化时是同源还是异源二聚体等问题都尚待研究。通过分析商品化的玉米来源的淀粉也含有 14-3-3 蛋白，说明其对淀粉合成的调节作用也存在于拟南芥以外的其他作物以及叶绿体以外的其他质体中21。 通过对已知的淀粉合成相关酶类序列中 14-3-3 蛋白结合序列的调查，SS家族极有可能是其在叶绿体中的靶蛋白21。值得注意的是，SS蛋白与支链淀粉的合成
14、直接相关，且对其他的 SS 同工型有显著的控制作用。 与参与糖代谢的其他物质不同，淀粉在所有的 14-3-3 蛋白抑制表达植株中，含量几乎都表现为上升7，11，12，21，虽然这其中不能排除SPS 的活性上升的作用，但是至少还有两种因素需要考虑，第一，研究发现，14-3-3 蛋白可以影响马铃薯体内的儿茶酚胺的含量，并进而改变可溶性糖与淀粉的比例；第二，在拟南芥中检测到 14-3-3 蛋白与淀粉磷酸化酶之间的直接反应对淀粉合成有影响。因此，有至少两条可能增加淀粉合成的途径是对 14-3-3 蛋白依赖而对 SPS 不依赖的12。 5 展望 14-3-3 蛋白表达广泛，功能复杂，引人瞩目，已有 20
15、0 多种蛋白质被证明可以在体内与它相互作用，其中包括各种蛋白激酶、受体、支架7蛋白、细胞周期调控蛋白、转录因子和凋亡调控蛋白、线粒体、叶绿体前体蛋白等23。14-3-3 蛋白参与植物中很多生理过程调控，如参与植物对各种疾病和环境胁迫的应答，在抵御疾病和抗胁迫中起重要作用；14-3-3 蛋白通过对蔗糖磷酸合成酶活性的调节从而控制植物碳氮代谢来改变植物吸收氮营养的能力24，25。14-3-3 蛋白调节植物糖代谢的关键酶活性，研究其在植物糖代谢中的作用，来提高作物产量和改良作物品质具有重要的理论和实际意义。 参考文献 1 Moore B， Perez V. Specific acidic prote
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