1、COPD 患者外周骨骼肌萎缩中的功能性蛋白组学的研究摘要：目的 对正常老年人、COPD 患者无外周骨骼肌萎缩、COPD 患者合并外周骨骼肌萎缩的蛋白电泳图谱进行配对分析比较，寻找差异蛋白质点。方法 应用质谱鉴定技术，对差异蛋白质点进行鉴定。结论 经相关文献检索，分析所鉴定的蛋白质在 COPD 患者外周骨骼肌萎缩的关系，为今后新的治疗靶点的研究奠定基础。 关键词：慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌萎缩；蛋白质 近年来，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的发病率和病死率正逐年增加，不是一种单纯的肺部疾病，而是可以累及引起全身炎症、心血管系
2、统、消化系统、骨骼肌萎缩、骨质疏松等具有广泛的肺外损伤的全身疾病，尤其是不明原因的骨骼肌萎缩和体重减轻及功能障碍1。分析与肌肉萎缩相关的关键蛋白质及其功能可能对治疗具有重要的临床指导意义。 1 资料与方法 1.1 蛋白质取材 30 例老年人，年龄均在 7090 岁，无 COPD 组（正常组）10 例，COPD 患者无外周骨骼肌萎缩组（无萎缩组）10 例，COPD患者存在外周骨骼肌萎缩组（萎缩组）10 例，分别取髌骨上 15cm 股四头肌的外侧肌；所有肌肉样品，在切取后立刻用冰的 PBS 冲洗，去掉组织中残留的血液等，剪成碎片置于 1.5ml Eppenderf 管中，并储存于-80。1.2 方
3、法 1.2.1 蛋白质的制备：将收集完的样品，用电子天平称取等重量样品（50mg）用预冷的 0.01 mol?L-1PBS：（磷酸盐缓冲液）洗涤 3 次，预冷的蒸馏水洗涤 1 次，出去渣滓，在液氮中制动研磨至粉末状，加适量裂解液充分混匀，在 4冰浴静置 15min，冰浴超声、离心，后取上清，用bradford 法测其标本的浓度，分别取样本量 1000g 均于-80冰箱中保存备用。 1.2.2 双向凝胶电泳、染色剂脱色：第一向等点聚焦：从冰箱中取出IPG（17mm PH3-10）预制胶条分成三组，经过与溶胀缓冲液充分混合、稀释、过滤、蒸发制成胶条立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳。第二
4、向 SDS-PAGE 电泳：拿出胶条放在平衡缓冲液中水平缓慢摇动平衡，再转移至平衡缓冲液中水平缓慢摇动平衡等一系列处理后凝胶，进行染色、脱色。 1.2.3 蛋白图象采集与分析：染色、脱色完成后的双向电泳凝胶，用凝胶图像扫描仪透射扫描获得图像，发送图象至 ImageMaster 的软件分析程序进行下一步凝胶图象的分析。蛋白质斑点检测，调整峰值、边缘以及利用子模式中的增删、分割等找出代表同一蛋白质的点，以比较不同凝胶中的蛋白表达情况。 1.2.4 胶内酶切和质谱分析：选择双向凝胶电泳匹配后找到的差异非常显著的蛋白点自动匹配，将电泳后凝胶中差异非常显著的蛋白点切出，反复清洗，脱色后的胶块在真空离心干
5、燥机内干燥，使胶块完全脱水体积缩小成近似球状，离心干燥。所有的 PMF 质谱图 MALDI-TOF-MS 分析，通过 PMF 鉴定蛋白质可以根据分子量、等电点、肽段匹配数、寻找匹配的相关蛋白质。 1.3 统计学方法 应用 SPSS11.5 统计软件包方差分析及显著性 t 检验。进行统计学处理，数据均用（xs）表示，P 值0.05 为有统计学意义。 2 结果 2.1 蛋白质的浓度测定结果 经过 Bradford 法测得样本蛋白质的浓度为，正常组 8.31g/l，非萎缩组：10.61g/l，萎缩组9.54g/l。 2.2 双向凝胶电泳图 见图 1。 2.3 差异表达蛋白 根据蛋白点的面积、灰度值及
6、光密度值等参数，用 ImageMaster2D Platinum Software 软件对正常组、萎缩组、非萎缩组蛋白图谱进行分析比较，发现 COPD 患者蛋白图谱中有 17 个蛋白斑点表达量与正常组有显著差异（差异为 Vol%值上调或下调 2 倍以上） ，用胰蛋白酶消化后，进行 MALDI-TOF-MS 检测，得到肽质量指纹谱。径 Mascot查询 SWISSPROT 数据库，结合 2-DE 凝胶上蛋白点的分子量和等电点，得分超过 66 分（P0.05）将被认为是可靠鉴定的结果，其中有 10 个超过66 分，推测功能性蛋白可能为烯醇酶-1，碳酸脱水酶（碳酸脱水酶） ，肌钙蛋白 T 和几种血红
7、蛋白。 3 讨论 通过蛋白组学的方法比较正常组、非萎缩组、萎缩组的蛋白表达量的差异，本实验研究结果发现几个功能性蛋白表达量在三组中有着明显的差异。以下将逐一详细讨论。 3.1 烯醇酶-1（ENO1） 烯醇酶-1，是一种存在于肌肉等组织里的酶，在碳水化合物的新陈代谢中起着重要作用。在糖类的发酵、酵解中，此能量通过丙酮酸激酶的作用用于 ATP 的生成；还能与细胞骨架蛋白和多聚核苷酸结合1-2，是纤溶酶原、层粘连蛋白的受体等3，ENO1 作为纤维蛋白溶酶原受体、纤维蛋白溶酶原结合蛋白，将纤维蛋白溶酶原结合于细胞周围并促其活化，活化的纤维蛋白溶酶原发挥其蛋白水解酶的作用，激活纤溶酶其表达增加将使成肌细
8、胞表面纤溶酶的产生增加。在本研实验究中，我们发现无论是非萎缩组还是萎缩组表达量都是上调的；推测可能在患者在长期慢性缺氧时，出现有氧呼吸的 ATP 能量生成不足，使得烯醇酶-1 表达量增加来促进 ATP 生成，这是与 COPD 患者氧通气不足引起的无氧呼吸糖酵解是相吻合的；当缺氧进一步加重时，可能出现烯醇酶启动纤溶酶系统开始分解骨骼肌肌纤维，来满足能量的不足，进而引起骨骼肌纤维的减少，即发生骨骼肌的萎缩；国内外并未见有关于COPD 患者骨骼肌蛋白酶在调节骨骼肌萎缩上报道，可能还存在其他途径能使该蛋白酶在表达量上的变化，其具体途径仍需要进一步的研究，分析该蛋白酶在调节骨骼肌蛋白分解及代谢上的分子机
9、制。 3.2 碳酸脱水酶（CA） 碳酸脱水酶是碳酸苷酶的一种，它们都具有共同的主要功能：在血液及其他组织中维持酸碱平衡；帮助体内组织排除二氧化碳；确保以 CO2 和 HCO3-为催化底物的酶保持适度的底物浓度，参与体内酸碱平衡调节及离子交换等过程起重要的作用；碳酸酐酶是红细胞的主要蛋白质成分之一，在红细胞中的地位仅次于血红蛋白；本实验结果分析发现，存在有两种形式碳酸脱水酶同工酶，根据肽段的匹配更接近与碳酸酐酶（CA）的结构，CA肽链均由 259个氨基酸组成；就目前的了解，CA除上述功能外，可能存在的生理作用主要有 3 点：由于 CA具有水化酶的功能，因此可以促进将 I 型肌纤维代谢过程中产生的
10、 CO2 运送出细胞；由于 CA具有磷酸酶活性，它可能参与细胞内的信号转导；由于肝脏，脂肪细胞和骨骼肌的功能均与能量代谢有关。研究还发现，在重症肌无力患者的骨骼肌上测得CA蛋白的表达水平明显减少4。对于重症肌无力骨骼肌中 CA蛋白缺乏的认识，其可能与骨骼肌的易疲劳和收缩无力有关5。本研究结果分析，CA均在非萎缩组及萎缩组都明显的升高，当在 copd 患者中，推测原因有两种，由于 CO2 的储留引起碳酸的升高，故体内的 PH 降低，机体为调解体内的酸碱平衡，促进 CA的生成来维持机体的酸碱平衡，促进 CO2 排除细胞外而维持体内酸碱平衡；由于患者的运动耐力减弱、骨骼肌收缩力减弱，机体为增加肌肉收
11、缩力而对 CA增加的调节，来抵抗肌力的下降；这一点与上述理论是相吻合的，另外 CA还具有磷酸酶的活性，磷酸酶是细胞信号传到的一种重要的酶，故 CA是否在信号传导上存在对骨骼肌的调节？是否还参与 copd 患者外周骨骼肌蛋白的分解等的作用分子机制还有待进一步研究。 3.3 肌钙蛋白 T（TnT） 肌钙蛋白位于肌纤维之中，是横纹肌收缩的重要调节蛋白，是调节 Ca2+的可逆作为肌肉收缩离合开关。肌钙蛋白 T（TnT）是肌钙蛋白其中 1 个亚基，在骨骼肌收缩和舒张过程中起重要调节作用，与原肌球蛋白结合，是肌肉的主要调节蛋白；本实验研究慢肌中的肌钙蛋白 T 同工型在非萎缩组和萎缩组均有明显的升高，但在后
12、期发生骨骼肌萎缩时，肌钙蛋白T 有所下降，但还高于正常组，根据以上的理论与实验结果综合分析认为在 copd 初期未发展到骨骼肌萎缩时，骨骼肌收缩与舒张较正常下降，机体为抵抗骨骼肌功能的减弱，增加肌钙蛋白 T 同工型来结合钙离子增加粗肌丝与细肌丝的运动，增加骨骼肌的运动耐力，维持正常运动。推测copd 患者缺氧逐渐加重、病情逐渐发展，合成 ATP 进一步的减少，甚至发展到合成 ATP 不足，引起骨骼肌蛋白的分解来弥补供能的不足，即骨骼肌纤维的减少，发生萎缩，故肌钙蛋白 T 较前有所下降；但在研究肌钙蛋白 T 在骨骼肌上的很少，是否也存在骨骼肌的坏死、降解等机制仍不清楚，其分子机制还待进一步的研究
13、。 总之，目前工作证明了使用蛋白质组学分析骨骼肌萎缩相关蛋白质的可行性和有效性。本研究方法及结果将给人的骨骼肌肌肉萎缩原因带来的可能理解，并能对临床诊断或者药物发现的潜在目的，筛选一些“疾病特异蛋白“提供帮助。 参考文献： 1Sousa L P，Brasil B S，Silva BdeM，et al.Characterization of alpha-enolase as an interferon alpha alpha 1 regulated gene J.Front Biosci，2012，10 （5）：2534-2547. 2Ghosh A K，Steele R，Ray R B.C2m
14、yc p romoter binding p rotein1（MBP-1） regulates p rostate cancer cell growth by inhibitingMAPK pathwayJ.JBiol Chem，2005，280（14）：14325-14330. 3 Lopez Alemany R，SuelvesM，Diaz Ramos A，et al.Alpha-enolase plasminogen recep tor in myogenesis J.Front Biosci，2005，10（1）：30-36. 4都爱莲，任惠民，吕传真，等.P25 蛋白在重症肌无力患者中的低表达及组织和种属特异性的研究J.中华医学杂志，2004，84：103-106. 5涂江龙，任惠民，吕传真，等.重症肌无力患者骨骼肌中碳酸酐酶蛋白减少的原因J.中华神经科杂志，2007，40：207-211.编辑/哈涛
