1、Notch3 在乳腺组织中的表达以及与乳腺癌癌变进展的关系摘要：目的 检测乳腺组织中 Notch3 的蛋白表达水平，以及分析其与乳腺癌患者临床病理参数的关系。方法 应用免疫组织化学染色方法检测了 Notch3 在癌旁正常乳腺组织和乳腺浸润性导管癌中的表达水平，并且运用统计方法进一步分析了 Notch3 表达水平和乳腺癌患者临床病理参数的关系。结果 Notch3 的蛋白水平在乳腺癌组织中显著高于癌旁正常乳腺组织，P=0.000；Notch3 的蛋白高表达和乳腺癌患者淋巴结转移呈正相关，P=0.000，在 TNM 各分期中差异明显，和更高的分期呈正相关，P=0.004；在病理学分级中差异明显，和更
2、高的分级呈正相关，P=0.035。结论 Notch3 的高表达可能存进乳腺癌的癌变和进展。 关键词：Notch3；Notch 信号通路；乳腺癌 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是威胁女性健康的主要原因之一，虽然随着诊断及先进治疗手段的普及，乳腺癌的预后已经较之前有了很大提升，但是乳腺癌整体的防治还亟需继续探寻1。而近年来，研究乳腺癌的分子诊断标记物和分子靶向治疗成为一个重点趋势。 Notch3 是 Notch 受体家族中的一员，其位于 19q12 染色体上，由 33 个外显子组成，编码 1 个由 2321 个氨基酸组成的跨膜蛋白受体，和家族其它成员相似，也是由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组
3、成，在和Notch 家族配体结合后，激活 Notch 信号通路，进而发挥调控细胞生长发育、增殖和凋亡以及维持干细胞的作用2。进来研究发现包括 Notch3在内的 Notch 信号通路的激活以及其活性分子的活化可以促进肝细胞癌3、结肠癌4和卵巢癌5等肿瘤的发生及进展，特别是 Hu C 和 Chen CF 发现在乳腺癌小鼠模型和细胞株中，Notch3 的过表达可以促进乳腺癌的发生和进展6-7。于是本课题组设想在乳腺癌人组织中验证上述发现。1 资料与方法 1.1 一般资料 收集 2006 年2014 年石河子大学医学院第一附属医院病理科被诊断为乳腺浸润性导管癌（IDC）的石蜡包埋组织标本，共计90
4、例，均为女性，年龄 3072 岁，中位年龄 55 岁，平均年龄 50 岁，同时收集对照癌旁正常乳腺组织 30 例。所有样本均由本科室 2 名高年资病理学医师对 HE 染色切片进行组织学观察和复查诊断，并进行分型、分级，其中 TNM 分期，0期 20 例，期 35 例，期 35 例；病理学分级，高分化（级）乳腺癌 13 例，中分化（级）乳腺癌 50 例，低分化（级）乳腺癌 27 例。 1.2 试剂 中性福尔马林固定液、乙醇、二甲苯、枸橼酸盐、Z 中性树胶、DAB 显色液、H2O2 均为国产产品。EnVision 试剂盒购自于丹麦Dako 公司，Notch3 抗体购自 abcam 公司，克隆号为
5、ab60087，抗体来源兔抗人，稀释浓度为 1：200。 1.3 免疫组化染色 免疫组化采用 Envision 法。将烤好的切片依次轻放入二甲苯 I、II、III 中；然后将脱蜡后的切片按顺序浸入装有梯度乙醇溶液的液缸中；采用微波修复方法，将修复完的切片浸入新配制的 3%甲醇双氧水溶液中，室温放置 10min，然后用自来水冲洗 12 次；每张切片滴加已稀释至最佳工作浓度的一抗各 160l，放入 4冰箱过夜，孵育；将过夜后的切片从 4冰箱取出，室温放置 10min；每张切片均滴加二抗各 160l，放入 37恒温箱，孵育 30min；每张切片滴加 12 滴新配制的 DAB 显色液，显微镜下观察组织
6、显色情况；显色完成后迅速用自来水冲洗，放入苏木素中复染 2.5min，盐酸酒精分化 46s，然后自来水中返蓝 3min；切片再次脱水、透明，中性树胶封片。 1.4 免疫组化结果评定 Notch3 染色后出现细胞浆和/胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选取 10 个高倍视野（400） ，每个高倍视野计数 100 个细胞，参照许良中8等的方法， 再结合本实验室的评定标准，将切片中阳性细胞所占观察细胞数的百分比10%计 1 分，11%50%计 2 分，51%75%计 3 分，76%100%计 4 分；着色强度无着色计 0 分，淡黄色计 1 分，棕黄色计 2 分，棕褐色计 3 分，由两项积分相加
7、进行评分；05 分评为阴性表达（-） ，6 分评为阳性表达（+） 。 1.5 统计学分析 应用 SPSS 17. 0 软件进行统计学分析，计数资料采用四格表或列联表 2 检验法，以 =0.05 双侧检验为检验显著性水准，P51%；而在癌旁正常乳腺组织中多无着色或淡黄色，阳性细胞所占百分比多51%。统计数据结果见表 1 所示，Notch3 蛋白在乳腺浸润性导管癌（IDC）和癌旁正常乳腺组织（ANBT）中阳性表达率分别为52.3%（47/90）和 6.7%（2/30） ，采用 2 检验比较显示，二者表达差异有统计学意义（P=0.000） 。 图 1 Notch3 蛋白在乳腺浸润性导管癌（IDC）和
8、癌旁正常乳腺（ANBT）的表达（EnVision200 1：200） 2.2 Notch3 蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系 结果如表 2所示，在淋巴结转移阴性（-）和阳性（+）的患者中，Notch3 蛋白表达率分别为 18%（5/28）和 68%（42/62） ，差异有统计学意义（P=0.000） ；在 0-I、II 和 III 期的患者中，Notch3 蛋白表达率分别为 25%（5/28） 、49%（17/35）和 71%（25/35） ，差异有统计学意义（P=0.004） ；在 I、II和 III 级的患者中，Notch3 蛋白表达率分别为 23%（3/13） 、52%（26/50
9、）和 67%（18/27） ，差异有统计学意义（P=0.035） 。 3 讨论 Notch 信号通路的激活与乳腺癌的发生发展有着密切的联系，Notch 通路中有 5 种 Notch 配体，包括 Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和 Delta4，4 种受体，包括 Notch1、Notch2、Notch3 和 Notch4。本实验组前期研究结果表明，Notch 信号通路分子中的 Notch1 蛋白9、N1IC蛋白10和 Snail 蛋白11高表达分别与乳腺癌变、侵袭转移呈正相关，说明三者可能促进乳腺癌的发生、发展过程。课题组前期也在乳腺组织中检测了 Notch1、N1IC
10、 及 Snail 蛋白表达，得出结论与文献结果一致。而除了 Notch1，Notch3 也被报道其高表达可能导致乳腺癌的发生6-7，并且预示着乳腺癌患者有着不佳的预后12，而这一些列促乳腺癌癌变的过程可能与 Her-2、ER 通路有关，抑制 Notch3 信号通路可能是靶向治疗乳腺癌的一个新的方向13。 本次实验结果表明，Notch3 蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中明显高于癌旁正常乳腺组织，阐明高 Notch3 表达可能促进乳腺癌的癌变，这也和前期在小鼠和乳腺癌细胞株中 Notch3 的研究相符6-7，Notch3 信号通路的异常参与了乳腺癌的癌变进展。接着我们在分析 Notch3 表达和乳腺癌
11、患者临床病理特征的关系时发现，Notch3 的高表达和乳腺癌患者的淋巴结转移、更高的 TNM 分期和较差的分化分级呈正相关，提示 Notch3的高表达和更差预后及恶性程度更高的乳腺癌联系紧密，而且可能促进了乳腺癌的浸润转移。而且近期有研究揭示，Notch3 的高表达和结肠癌的淋巴结转移以及更高的临床分期呈正相关，在低分化卵巢癌、淋巴结转移和血行转移的卵巢癌中 Notch3 更易发现高表达。这些和我们的发现都进一步提示我们，Notch3 可能参与促进乳腺癌的癌变和进展，Notch3表达水平有可能作为预测癌症侵袭转移的重要指标和对预后判断具有一定价值。 当然，本次实验仍存在着种种不足之处。首先，更
12、多的样本量需要被添加在今后的进一步研究中，其次，在乳腺组织中除了检测 Notch3 蛋白水平外，我们还可以在用 RT-PCR 方法检测 Notch3 的 mRNA 水平，最后，当前估算患者预后较精确的有总生存率和无病生存率，我们可以随访实验纳入的乳腺癌患者的生存资料，进行进一步的生存分析。本次实验结果给予我们后续研究提供了一个基础，也为 Notch3 可能作为一个潜在的乳腺癌诊断分子标记物和靶向治疗药物提供了初步的实验依据。 参考文献： 1Hong W， Dong E. The past， present and future of？breast cancer？research in Chin
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