1、PED 相关粪肠球菌生物膜中胞外 DNA 作用的研究摘要：目的 就 PED 相关粪肠球菌生物膜中胞外 DNA 作用进行研究。方法 选择根管治疗术失败或者被诊断为顽固性根尖周炎的单根管牙，并且提取根管内粪肠球菌，鉴定粪肠球菌，制备粪肠球菌菌液，配制核酸染液。结果 实验组在培养 24h 后基本都没有菌胞附着，而对照组却出现了较为密集的成熟生物膜结构。在 PED 相关粪肠球菌生物膜的形成过程中，胞外 DNA 会发挥出极为重要的作用。结论 胞外 DNA 能够成为攻克PED 相关粪肠球菌生物膜的新靶点，具有极为突出的作用效果。 关键词：PED 相关；粪肠球菌生物膜；胞外 DNA；作用 根管生物膜的存在是
2、导致根管治疗术失败，以及根尖感染性疾病、牙髓感染性疾病经久不愈的主要原因，而粪肠球菌则是主要导致根管内感染治疗失败的致病菌。生物膜会让粪肠球菌长期生存于高抗菌药性、高碱性、营养物质缺乏的恶劣环境中，并且还会出现再感染的问题1。实验表明：PED 相关粪肠球菌生物膜中胞外 DNA 作用极为有效，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 菌株和试剂 粪肠球菌、BhI 液体培养基、吖啶橙、ClED 培养基、溴化已锭（EB） 、DNASEI。 1.2 方法 1.2.1 提取根管内粪肠球菌 选择根管治疗术失败或者被诊断为顽固性根尖周炎的单根管牙。牙体髓室和表面用碘伏（20g/l）进行消毒，在根管内插入标准纸捻
3、，在根尖孔处停留 10s。然后将纸捻取出，立即浸入到移液管中（盛有琉基乙醇酸盐转送液，剂量为 1.0ml） ，浸泡 30min 后送检。再用漩涡振荡器振荡 1min 移液管，将全部样本的剂量都调整到300l，离心 10min。再用 PBS 稀释，震荡混匀。在 ClED 鉴定培养基上接种 50l，放置在温度为 37的环境内培养 18h。 1.2.2 鉴定粪肠球菌 细菌学鉴定：基于 ClED 鉴定培养基上菌落的颜色和形态来鉴定是否为粪肠球菌，假定直径约 0.5mm、颜色的黄色的菌落为粪肠球菌。 生化反应：65g/l 氯化钠肉汤、胆汁七叶苷、阿拉伯糖、甘露醇均为阳性；山梨糖、触酶均为阴性。在 BhI
4、 琼脂培养基中接种菌株，保存温度为-4。 1.2.3 制备粪肠球菌菌液 将单菌从 BhI 琼脂培养基（已分离纯化）取出，在 BhI 液体培养基中接种，并且放置在设定温度为 37的恒温培养箱中常规培养 24h，离心 10min，离心速度为 4000r/min。洗菌 2 次，再加入无菌的 BhI 液体培养基来配制成菌液（OD600=0.6） 。取 2ml 菌液放置于试管中，基于 NCClS 标准方法来合理配制，在 30min 内完成，将配制好的菌液接种。 1.2.4 配制核酸染液 取 1mg 溴化已锭、1mg 吖啶橙溶于 PBS 溶液（Ph 值为 7.0，剂量 10ml） ，配制成储备液（浓度为
5、100g/ml） ，等份混合 EB 储备液及吖啶橙稀释成工作液。 1.3 DNASEI 对粪肠球菌生物膜形成的影响 将一个灭菌的盖玻片（规格为 20mm20mm）放入细胞培养皿（直径 35mm）内，取 1ml 无菌 BhI 培养液及 1ml 菌液混合后滴至盖玻片表面。对照组加入 2ml 的 BhI 培养液，实验组加入 2ml 的 DNASEI（浓度为 100U/ml） 。封闭方式选用封口膜，放入 37恒温箱常规培养。在培养 24h 再取出，将封口膜开启，吸净液体。为了能够将表面浮游细菌去除，可再用 1mlPBS 洗涤 2 次，然后再将200l 核酸染液滴加到生物膜表面，然后黑暗室温孵育 2mi
6、n 以便进行ClSm 观察。 1.4 DNASEI 对自由生长至不同时段的生物膜的影响 在 6 孔培养板中放入盖玻片（规格为 20mm20mm） ，取 1mlBhI 培养液和 1ml 标准菌液进行混合，而后滴至盖玻片表面，封闭封口膜，37培养 6 个时段（分别是 48h、36h、24h、18h、12h、6h） 。 1.5 定量分析红绿荧光 生物膜全部区域的各个层面都用 ClSm 予以逐次扫描，对红绿光面积进行分别统计，进而对生物膜活性予以计算。生物膜活性=绿荧光量/绿荧光量+红荧光量。 2 结果 2.1 DNASEI 对粪肠球菌生物膜形成的影响 实验组在培养 24h 后基本都没有菌胞附着，而对
7、照组却出现了较为密集的成熟生物膜结构。 2.2 DNASEI 对自由生长至不同时段的生物膜的影响 根管内粪肠球菌生物膜的生长活性在各个阶段都被 DNASEI 明显降低，与对照组存在着较为明显的差异，具有统计学意义（P0.05） ，生物膜中胞外 DNA 随着生物膜的生长而增多；由此可见，在 PED 相关粪肠球菌生物膜的形成过程中，胞外 DNA 会发挥出极为重要的作用。 3 讨论 本研究采用溴化已锭（EB）染色剂作为胞外 DNA 的染色剂，溴化已锭的灵敏性较高，在检测 DNA 中常被使用。EB 虽然不能将检测 DNA 直接穿过，但是却含有一个与碱基位置接近的平面基团，使得 DNA 与染料结合，并呈
8、现出较为明显的荧光。共聚焦显微技术既可定位细胞内荧光，又能够定量分析细胞内荧光， ，获得分布在样品不同部位的荧光强度数值及变化情况。 本研究对 PED 相关粪肠球菌生物膜中胞外 DNA 作用进行探讨过程中，利用了生物制剂 DNaseI，DNaseI 是一种特异性 DNA 水解酶。将 DNaseI放置在培养皿中 24h 后，却基本没有菌落出现在玻片上，而 24h 生物膜却出现在没有放置 DNaseI 的玻片上，这充分说明：胞外 DNA 与 PED 相关粪肠球菌生物膜的形成密切相关2-3。而实验表明：早期生物膜的继续形成可被 DNaseI 成功抑制，能够明显分解已成熟的生物膜，这充分说明：胞外 DNA 对 PED 相关粪肠球菌生物膜成熟后的扩散增厚都有着极为重要的意义。总之，胞外 DNA 能够成为攻克 PED 相关粪肠球菌生物膜的新靶点，具有极为突出的作用效果。 参考文献： 1古丽莎，凌均?.根管生物膜及其临床控制的研究进展J.国际口腔医学杂志，2006，33（5）：349-351. 2文静，范兵.根管内粪肠球菌感染的研究进展J.国际口腔医学杂志，2007，34（1）：13-15. 3倪玉华，张建军，孙宝贵.DNA 酶的研究进展J.国际病理科学与临床杂志，2006，26（6）：531-535.编辑/金昊天
