1、斑马鱼中 snrpc 基因的发育时序表达分析摘 要：为了深入研究鱼类 snrpc 基因的作用机制，通过分析斑马鱼 snrpc 的发育时序表达，来探讨 snrpc 基因在斑马鱼中的功能机理。从斑马鱼的胚胎中提取 RNA，进行反转录、PCR、克隆等，得到 snrpc 基因在胚胎发育不同时期的表达水平。结果表明，在斑马鱼胚胎发育初期，snrpc 表达量较高，随着胚胎的不断发育，snrpc 的 mRNA 表达量有所下降，到后期表达量又上升。因此，snrpc 表达量的变化可能预示着 snrpc发挥功能的关键时期，对 snrpc 的克隆和表达分析，为后续进一步研究其相关功能奠定了基础。 关键词：斑马鱼；时
2、序表达；snrpc 中图分类号 S965.299 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-14-02 Abstract：In order to further study the mechanism of snrpc in fish，we analysed the temporal expression of snrpc to explore the potential function of snrpc gene in zebrafish.In this study，the total RNA was extracted from zebrafish embryos，t
3、hen cDNA was synthesized by reverse transcription. The snrpc gene was amplified successfully by PCR. The temporal expression pattems of ssnrpc among embryonic development were analyzed by RT-PCR. Results showed that the snrpc mRNA were mainly transcribed in the initial development of zebrafish embry
4、os. With the embryonic development，the snrpc mRNA decreased.In the late stages of embryonic development，the mRNA rise again. Therefore，the changes may indicate that high mRNA level stages are the key periods. The cloning and expression characterization of snrpc laid the foundation for the further st
5、udy of gene function. Key words：Zebrafish；Temporal expression；Snrpc snRNP 蛋白在 mRNA 前体剪切中发挥着重要的功能1-2。本实验室在斑马鱼卵巢文库中扩增到一种 snrpc 基因。研究证明在两栖类的卵细胞中发现有 SNRPC 蛋白，但在鱼类中，仅在鲫鱼中有报道，但未作深入研究3-5，在鱼类中 SNRPC 蛋白如何发挥功能仍是未知数。在本研究中，通过分析斑马鱼 snrpc 的发育时序表达，来探讨其在斑马鱼发育过程中的功能机理，以期填补这方面研究的空白。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 斑马鱼的胚胎培养 斑马
6、鱼（Danio rerio）置于（281）的水循环系统中进行养殖。 1.1.2 主要仪器设备 Sequi-Gen 电泳仪系统，Bio-RabGONGSI 公司；PCR 仪，Bio-RabGONGSI 公司；定量移液器，法国 Glison 公司；Bio-RabGONG-SI 公司，凝胶成像系统，高速冷冻离心机；隔水式恒温培养箱，上海精宏实验公司；超净工作台；低温水浴锅；恒温水浴锅；恒温摇床，上海精宏实验公司。 1.1.3 主要试剂 PCR taq 酶，TaKaRa 公司；限制性内切酶，NEB 公司；PCR 纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、酶切胶回收试剂盒，上海生工；T4 连接酶购，Promega；K
7、OD kit，TOYOBO。 1.2 实验方法 1.2.1 斑马鱼 snrpc 的克隆 （1）RNA 的提取；（2）mRNA 逆转录成cDNA；（3）PCR 扩增目的基因 snrpc。 将 PCR 的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将与预期一致的条带回收，连接、转化及阳性克隆鉴定。 1.2.2 mRNA 表达水平检测 1.2.2.1 各个时期胚胎 RNA 的提取和 cDNA 的合成 和前面总 RNA 的提取和反转录合成第一链 cDNA 的方法一样，各个时期的胚胎各取50100mg。 1.2.2.2 RT-PCR 检测 mRNA 水平 RT-PCR 中用到的引物如下： 2 结果与分析 2.1 sn
8、rpc 基因克隆的结果及序列分析 用 oligo dT 引物逆转录合成mRNA 的第一链 cDNA。根据 NCBI 上预测的 snrpc 的全基因序列，设计引物，以第一链 cDNA 为模板 PCR 扩增 snrpcc 的 ORF 序列，得到与预期大小一致的条带（如图 1） 。由图 1 可知，在 500bp 与 250bp 之间的 400bp处存在较亮条带与目的 DNA 条带大小相符，扩增片段正确。回收后，将该片段连接到 pGEM-T vector 上，转化到大肠杆菌 JM109 中，挑取单克隆，通过菌液 PCR 鉴定阳性克隆，测序结果显示与预期一致。snrpc 的cDNA 全长为 398bp，
9、包含 3 个部分，一个 282bp 的开放阅读框（ORF） ，编码 94 个氨基酸，长度为 52bp 的 5非编码区（5-UTR，5-untranslated region） ，长度为 64bp 的 3非编码区（3-UTR，3-untranslated region） ，有一个多聚腺苷酸加尾信号 AATAA 和一个多聚腺苷酸尾巴。 2.2 snrpc 在胚胎发育不同时期的 mRNA 水平 为了进一步探究 snrpc 在斑马鱼胚胎发育各时期中所发挥的作用，本节中通过RT-PCR 反应研究了在斑马鱼胚胎发育不同时期 mRNA 水平（如图 2） 。首先提取了不同发育时期胚胎的总 RNA，通过 mRN
10、A 逆转录合成 cDNA，-actin 作为内参，以 cDNA 为模板，用 -actin 引物进行 PCR 反应，确保提取的各时期 RNA 的逆转录效率大体一致，再以 snrpc 的引物进行 PCR扩增，通过电泳检测，反应出胚胎发育各时期 mRNA 的表达量。 如图 2，通过 RT-PCR，检测到 snrpc 在斑马鱼早期不同胚胎发育时期的表达情况。结果显示，斑马鱼 snrpc 从受精后 0h 开始有表达，且表达量较高，在 4hpf 开始表达量降低，随后的 69hpf 表达量最低，基本检测不到。12hpf 时短暂升高，之后的 1224hpf 表达量再次降低，从36hpf 之后表达量再次升高并维
11、持在相对较高并稳定的水平。因此，斑马鱼 snrpc 为母源性基因，且在早期胚胎发育过程中呈现动态表达。 3 讨论 为了研究 snrpc 基因在斑马鱼中发挥的功能，克隆得到了 snrpc 基因的 ORF 序列。通过 RT-PCR 研究结果表明，snrpc mRNA 在斑马鱼不同发育时期的表达情况则都呈现出一个动态变化的过程，在斑马鱼胚胎发育初期，snrpc 表达量较高，可能参与了此阶段的 mRNA 前体的剪切加工。随着胚胎的不断发育，snrpc 的 mRNA 表达量有所下降，受精后 69h 完全检测不到，这说明母源基因的耗尽。到后期表达量又上升，尤其是 12h含量很高，说明 snrpc 很可能在
12、这个时期发挥重要作用。同时这也说明对 snrpc 的表达调节是一个多层次、多方面的调控过程，确保 snrpc 在斑马鱼生长发育过程中的精确表达。 参考文献 1Sillekens P.T.，Beijer R.P.，Habets W.J.，et al.Human U1 snRNP-specific C protein：complete cDNA and protein sequence and identification of a multigene family in mammalsJ.Nucl.Acids Res.，1988，16：8307-8321. 2Galliano M.，Minchi
13、otti L.，Campagnoli M.，et al.Structural and biochemical characterization of a new type of lectin isolated from carp eggsJ.Biochem.J.，2003，376：433-440. 3Jantsch M.F.，Gall J.G.Assembly and localization of the U1-specific snRNP C protein in the amphibian oocyteJ.J.Cell Biol.，1992，119：1037-1046. 4Wang H.Y.，Zhou L.，Gui J.F.Identification and characterization of an oocyte-specific small nuclear ribonucleoprotein polypeptide C in gibel carp，CompJ.Biochem.Phys.B，2007，146：47-52. 5王红莹，杜?.鲫鱼一种新型 SNRPC 基因的蛋白表达和抗体制备分析J.河北农业科学，2010，14（12）：43-45. （责编：张宏民）
