1、对头孢菌素 C 发酵工艺的优化研究摘 要目的：对头孢菌素 C（CPC）发酵工艺的优化进行研究，通过对接种方法、发酵培养基的调整和碳源的替代，经实验可知，移种加倒种罐发酵水平比正常移种罐发酵水平高，并且通过将发酵培养基进行调整，实现减少发酵罐培养基豆油用量，发酵过程中流加葡萄糖方式，不仅提高了发酵水平，而且也减少了基础料的成本，同时降低了单批能耗，从而也降低了生产成本。 关键词头孢菌素 C；发酵；培养基；工艺优化 中图分类号：S259 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）16-0343-01 头孢菌素 C（CPC）经化学裂解法或酰化酶法去掉侧链而得到 7-氨基头孢烷酸（7-A
2、CA） ，7-ACA 是合成的头孢类抗生素药物重要的医药中间体。头孢菌素 C 发酵培养基原材料成本占比 7-ACA 原材料成本 70%以上，目前很多的生产厂家开始着力提升头孢菌素 C 的发酵水平，以降低 7-ACA 成本，进而降低头孢类抗生素药品成本提升市场竞争力。目前我国主要生产头孢菌素 C 的厂家主要包括：哈药集团、石药集团、华北制药集团、山东鲁抗、山西威奇达、健康元等几家企业。 CPC 是由顶头孢霉菌初级代谢后在特定的环境条件下进行次次代谢产物。要想高效的提升 CPC 的发酵水平，就要从根本上入手，而 CPC 出现的根本就在于顶头孢霉菌的初级代谢。由于培养基中各种营养物质的浓度配比对菌体
3、的生长和代谢有着明显的影响，所以要合理配制培养基中的营养物质浓度，以保障菌体的正常生长。充分认识到碳、氮等基本营养元素在顶头孢霉菌的代谢过程中的作用，而且要注意的是，在顶头孢霉菌代谢的过程中要控制接种量，对各方面影响因素进行充分的考虑，只有这样才能够最大限度的提高头孢菌素 C 的发酵水平。本文的实验就是针对接种方式、减少发酵培养基豆油用量，发酵过程中部分糖代油的的方式进行优化，从而提高头孢菌素 C 的发酵水平。 1.材料和方法 1.1 菌种 顶头孢霉菌（哈药集团制药总厂生产用菌种） 。 1.2 培养基 1.2.1 种子培养基：葡萄糖，蔗糖，玉米浆，烤花生粉末，豆油，硫酸铵，CaCO3，消沫剂，
4、pH：6.4-6.6。 1.2.2 发酵培养基：葡萄糖，玉米淀粉，豆油，玉米浆，花生饼粉，谷朊粉，DL-蛋氨酸（进口） ，CaCO3，硫酸钙、硫酸铵等无机盐，消沫剂，pH：6.1-6.3。 1.3 设备 1.3.1 实验室设备：500ml 锥形瓶，3000ml 锥形瓶，30L 发酵罐。 1.3.2 发酵罐：一级种子罐 500L，二级种子罐 20m？，发酵罐60m？。 1.4 发酵周期 发酵周期为 1253h。 2.实验方法 2.1 通过对接种方法优化，提高发酵水平。 2.2 减少发酵培养基豆油用量，发酵过程中流加葡萄糖的的方式进行优化，对头孢菌素 C 的发酵生产工艺进行了改进。 2.3 测定菌
5、丝量方法：将均匀的发酵液倒入 10mL 刻度离心管中，置于离心机中，3500r/min 下离心 10min。 2.4 头孢菌素 C 含量用 HPLC 测定，其色谱条件为：色谱柱为C18，4.625mm；流动相为乙腈：乙酸钠缓冲液（1：50） ，进样量20l，流速：2.0ml/min，检测波长：254nm。 3.分析结果与讨论 3.1 接种方式的调整 头孢菌素 C 发酵种子的生长周期较长，但是发酵的周期却很短，这种特殊性决定了其要选用适合的发酵方式才能够保障发酵的水平。一般而言我国目前所采用的头孢菌素 C 发酵方式为三级发酵，但是在实际的移种过程中，由于发酵罐接种后有一个比较长时间的停滞期，在这
6、一时期，很多因素会对发酵种子产生影响，从而使得头孢菌素 C 的发酵水平下降。而想要有效的保障头孢菌素 C 发酵水平，就要极大的缩短停滞期的时间，将生长状况良好的 14m？二级种子移种到发酵罐中，这就是通常所说的移种罐。而通常的移种加倒种是指将 10m？二级种子移入发酵罐后，再倒入 4m？左发酵至 45h 左右右的发酵液，这样能够有效的减少停滞期，从而保障接种量。在移入的过程中，头孢菌素 C 合成所需要的酶也被共同带入，这样能够极大的促进菌丝量的增长，从而在整体上提高发酵水平。 为保障实验误差在最小值，本文进行了实验室规模的发酵实验确定了倒种罐的最佳周期为 4050 小时为宜。随后进行了 20
7、批大生产验证，在这 20 批实验中，有 10 批属于正常接种罐，而另外 10 批属于是移种加倒种罐，从实验的结果可知，移种加倒种罐要比正常的移种罐的发酵整体水平要高。前者比后者的效价要高 7.3%，而且在批总亿上也要高出8.0%左右，具体数据见下表。 移种加倒种的罐比正常移种罐有明显的优势，从开始效价就比正常移种罐批次高。 3.2 发酵培养基的调整及工艺优化 头孢菌素 C 发酵培养基营养十分丰富，尤其是豆油的加量非常大，但是头孢菌素 C 发酵是高耗氧的发酵，豆油过多使发酵过程中泡沫减少，溶氧偏低，如果发酵过程中溶氧一直偏低，不仅会造成发酵水平低，还会使发酵过程中 DOCPC 的含量增加，从而给
8、后续的提取增加困难，并且会使提取收率降低。为了弥补溶氧，需要提高搅拌功率或增加通气量，从而增加了动力消耗。由于基础料中油过多，在很长的发酵周期内发酵液中都会存在大量的油，中间带放时这些油就会随发酵液带出，不仅造成营养浪费，而且发酵液中大量的残油会使酸化板框滤布频频更新增加成本。根据这种情况，通过降低基础料中的油，通过适当加大 50 小时后流加葡萄糖和豆油量，克服了发酵过程中 3050 小时溶氧偏低，菌丝分化成孢子不完全的劣势，最终可以使 125 小时放罐 CPC 纯度达到 81.32%左右，叫基础料较少豆油时提升了 2.1%，且发酵罐在第一次带放时残油量已经很低，每批节省豆油 1.21.5m？
9、，大大降低了基础料的成本。且通过降低基础料中硫酸铵用量，在 1520 小时发酵液中氨氮迅速消耗时，一次性补如 350 公斤硫酸铵（1.2m？，浓度 30%左右） ，也可以改善前期溶氧，同时改变发酵液的无机盐浓度，进而可能会改变细胞渗透压，刺激微生物迅速生长，可以在 45h 时左右菌浓达到 46（V/V） ，提前 6 小时左右，可以相应缩短发酵周期。 在头孢菌素 C 发酵过程中要不断地补入葡萄糖和豆油。由于豆油的价格比糖要高数倍，豆油在头孢菌素 C 的成本中占的比例很大，所以考虑加大葡萄糖的加量，降低豆油的加量。但由于大量的葡萄糖对头孢菌素 C 发酵有阻遏作用，如果葡萄糖过量就会造成发酵异常，所
10、以葡萄糖又不能完全代替豆油。另外，由于在糖代油工艺调整过程中，糖增加的量大约是豆油加量的近 3 倍，所以在一定程度上对发酵液进行了稀释，使菌丝浓度降低了 2%左右，过滤收率提高了 0.7 个百分点，同时由于流加葡萄糖量加大，使放罐时孢子形态较完整，CPC 纯度也得到进一步保障。3.结论 通过调种接种方式，移种加倒种罐比正常移种罐效价高 7.3%，批总亿高 8.0%左右；通过较少基料中的豆油及硫酸铵，通过后期一次性补加或增大流加量，每批节省豆油 1.21.5m3，大大降低了基础料的成本；通过加大流加葡萄糖用量，相应减少豆油量，稀释了发酵液，使过滤收率提高 0.7 个百分点，同时由于流加葡萄糖量加
11、大，使放罐时孢子形态较完整，CPC 纯度也得到进一步保障。 参考文献 1 沈萍.微生物学M.北京：高等教育出版社.2000：84. 2 余俊棠等.新编生物工艺学M.北京：化学工艺出版社.2003：72-90. 3 熊宗贵.发酵工艺原理M.北京：中国医药科技出版社.1995：297-302. 4 任吉民.国内头孢菌素类市场发展综述J.中国制药信息，2004，20（11）：29-32. 5 徐兆瑜.头孢抗生素中间体的合成与生产发展J.医药化工，2005（6）：1. 6 孟庆艳，李福.新型氮在头孢菌素 C 发酵生产中的替代应用研究J.黑龙江医药，2006（4）：2 7 牛维兵，许朴勤，王静点，等.头孢菌素 C 的分离研究进展J.河北化工，2007（10）：38.
