人类疾病动物模型复制与评价.ppt

2019/7/1,1,第 3 讲 人类疾病动物模型复制及评价,Animal Models of Human Diseases,2,一、定义 模型（Model） 动物模型（Animal models） 人类疾病动物模型(Animal models of human diseases） 是指为生物医学研究和阐明人类疾病的病因、发病机理，建立预防、诊断和治疗方法而制作的具有人类疾病模拟表现的实验动物。,第一节 动物模型概述,3,为什么要在动物身上试验==在人身上试验的问题 受伦理学制约，许多实验不能直接在人体上进行 以人本身作为实验对象来推动医学发展是缓慢的 临床所积累的经验在时间和空间上都存在着局限性,一个好的疾病动物模型的建立可极大地促进该疾病发病机理、诊断、预防及治疗研究并开发出相关新药；而一种疑难病、烈性传染病，因为无相应的动物模型，限制了该病的深入研究。,4,二、应用疾病动物模型的意义 减少了在人身上进行实验所带来的风险； 缩短实验研究周期； 便于实验样品的收集； 便于研究结果分析； 可提供稀缺疾病的材料； 全面认识疾病的本质,5,三、疾病动物模型的制作原则 （1）确定性：能通过各种观察指标得到明确诊断； （2）完整性：能显示某种疾病从发病到转归的整个变化过程； （3）重复性：相近条件下，能够复制和再现； （4）规范性：有基本同一的操作规程、技术参数与观察指标等； （5）实用性：对药物疗效和安全性评价、临床诊治工作有意义等； （6）易行性：常规动物和试剂，制作方法简便，仪器设备普及，价格适中。,6,动物模型评价的注意点： 动物体毕竟不是人体的真实摹本，没有一种动物模型能完全复制人类疾病的状况。模型实验只是一种间接性研究。 2.对动物模型实验结果的评价应是相对的，不可绝对外推的人身上，最终必须在人体上得到验证。,7,四、人类疾病动物模型的分类 （一）按制作方法的分类 诱发性疾病动物模型 突变系疾病动物模型 1.自发性疾病动物 2.人工致突变疾病动物 转基因动物疾病模型,8,不同人类疾病动物模型的比较,9,（二）按照各系统疾病分类 可分为呼吸系统疾病动物模型、消化系统疾病动物模型……等。 （三）按照疾病基本病理过程分类 可分为发热、炎症、休克、电解质紊乱、酸碱平衡障碍、呕吐、腹泻动物模型……等。 （四）按照所用动物进行分类 例如小鼠模型、大鼠模型等。 （五）中医证候动物模型的分类 利用中医独特理论体系“辨证论治”，在实验动物身上复制不同的临床证候，以不同的证型表现出来，如气虚证、血虚证动物模型等。,第二节 肿瘤动物模型 1.自发性肿瘤动物模型 2.诱发性肿瘤动物模型 3.移植性肿瘤动物模型,1. 自发性肿瘤动物模型 ◆ 指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下发生的肿瘤所形成的模型。 ◆ C3H小鼠： 10月龄乳腺癌发病率为97% 14月龄雄性，肝癌自发率达84% ◆ AKR小鼠： 淋巴细胞性白血病发病率为70%～90%； ◆雌性F344大鼠： 乳腺肿瘤发病率为41%,◆ 注 意： 1. 适合做实验研究的动物自发性肿瘤，应选择最接近于人类的肿瘤。 2. 缺点：自发性肿瘤发病迟，发病时期不集中，发病率也不一致。,2. 诱发性肿瘤（induced tumor）动物模型 ◆ 是使用致癌因素在实验条件下诱发动物发生肿瘤的模型。 ◆ 方法： 1）原位诱发：指将致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤，接触方法可通过涂抹、灌注、喂养或埋置等 。 2）异位诱发：将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而产生的该组织或器官的肿瘤。异位诱发肿瘤具有易于观察和取材的优点。,◆ 诱癌物： 放射线局部照射、化学致癌物（烷化剂、亚硝胺类、芳香胺类）、生物毒素（黄曲霉毒素）、细菌（幽门螺杆菌）感染等。,◆ 举 例： （1）二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌： 采用小鼠皮下注射1％DEN水溶液，每周一次，(每次剂量为56mg/kg，总剂量为868mg)。观察时间为100d左右。此模型诱发率约40%。若将DEN总剂量增到1176mg时，半年诱发率可达90％以上。 （2）亚胺基偶氮甲苯(OAAT)诱发小鼠肝癌： 用l％OAAT苯溶液涂于动物两肩胛间皮肤上，隔日1次，每次2—3滴、一般涂100次。7个月以上诱发肝肿瘤约55％。 （3）黄曲霉素诱发大鼠肝癌： 在大鼠饲料中加入黄曲霉素，含0.011-0.015ppm，喂养6个月，诱发率达80％。,◆ 注 意： 1.致瘤方法、动物种系、致癌物种类与溶剂、给药剂量与途径及观察时间等尽量简便可行，有较好的重复性，并有利于与人肿瘤比较。 2.方法和种系应对所用致瘤物敏感。 3.致癌物的剂量应能保证动物存活率较高、诱发期较短而又可诱发较高频率的肿瘤。,3. 移植性肿瘤动物模型 ◆ 指将动物或人体肿瘤移植同种或异种动物连续传代而培养出的模型。 ◆ 方法 实体瘤移植：肿瘤细胞皮下接种——7-10d处死荷瘤动物——选择生长良好、无坏死液化的瘤组织——无菌套管针抽吸——接种同种受体动物右前腋窝皮下。 腹水瘤移植：肿瘤细胞腹腔接种——7-10d处死荷瘤动物——取腹水——腹腔注射（腹水瘤）或皮下注射（实体瘤）。,◆ 人体肿瘤的异种移植：,A: 移植于动物缺乏免疫防御机能的特殊部位 鸡胚、动物眼前房、地鼠颊囊。 B: 人工制造免疫缺陷动物 切除新生动物胸腺、脾脏、射线照射、免疫抑制剂。 C: 移植于先天性免疫缺陷动物 无胸腺裸鼠（nude）,◆ 国内、外的科学家已经建立起许多不同起源和不同特性的可移植性肿瘤细胞系或株。目前世界上大约保有近500种动物移植瘤株，但常用的只有40种，且多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤株。,http://cellbio.com.cn,http://www.bnbio.com/,◆常用的可移植性肿瘤细胞系（或株）：小鼠肉瘤S-180、肉瘤37（S-37）、小鼠淋巴细胞白血病L-1210、艾氏腹水瘤、小鼠网织细胞白血病615、Harding-Passey黑色素瘤、黑色素瘤B-16、小鼠肝癌H22、Lewis肺癌、小鼠乳腺癌（M5076）、大鼠Walker-256和吉田肉瘤等。,第三节 糖尿病动物模型,一、Ⅰ型糖尿病动物模型,二、Ⅱ型糖尿病动物模型,一、Ⅰ型糖尿病动物模型,(一)手术方法（胰腺切除法）1890年报道：切除狗胰腺，出现多尿，多饮，多食和严重的糖尿现象。 一般选用较大的实验动物，如狗和家兔等，其次用大鼠。 全切：无胰，需补充外源性胰酶。可引起高血糖，并可致酮症酸中毒和死亡 一般主张切除75%~90%的胰。,(二)化学药物特异性破坏胰岛β细胞 1.四氧嘧啶（alloxan） 产生超氧自由基而破坏β细胞，导致胰岛素合成减少，胰岛素缺乏。 豚鼠具有抗药性。 血糖反应3个时相： ①早期血糖升高,持续约2ｈ ②低血糖约6ｈ ③ 12ｈ后开始持久的高血糖,⑴小鼠： 剂量——200mg/kg(ip) ,85-100 mg/ kg(iv)。 随剂量的增加，小鼠死亡率增高; 小鼠体重增加，死亡率亦增高; 静脉注射成模率比腹腔注射高; 同等剂量分次给药，死亡率、转阴率均降低，成模率高。 最佳时间为禁食12--18ｈ后造模。 造模剂均需临用前配。,成模标准：造模后第3天CBG值>16.7ｍmol/l。,⑵大鼠： 影响因素：饲料成分、给药次数、给药剂量、动物体重、个体差异等。 静脉给药优于腹腔给药； 两步给药法：剂量为第1天120 mg/kg，第2天100 mg/kg。,⑶小型猪： 5%四氧嘧啶200 mg/kg静脉注射，出现高血糖，糖耐量减低，糖尿，低蛋白血症，肾上腺皮质损伤。,⑷家兔： 雌性较雄性耐受，死亡少，130 mg/kg为适宜。,2. 链脲佐菌素(streptozotocin) 三个时相： ①早期高血糖相，持续约1~2小时，乃此药抑制胰岛释放所致；②低血糖相，持续约6~10小时，可能是由于胰岛β细胞破坏，大量胰岛素释放，是血糖显著降低； ③24小时后出现稳定的高血糖相即糖尿病阶段，此时大部分胰岛β细胞已呈现不同程度的损伤和破坏。 与四氧嘧啶糖尿病不同，高血糖反应及酮症 均较缓和----死亡较少。,⑴小鼠： 敏感性较差，需静脉注射175~200mg/kg方可引起糖尿病。,⑵大鼠： 速发型模型：Wistar大鼠， ip 60mg/kg STZ， 1次 迟发型模型：Wistar大鼠，每周1次，连续3周，ip CFA （福氏完全佐剂）0. 5m1和STZ (25mg/kg)，。,⑶豚鼠： ip STZ 200mg/kg，24h后每天定时SC.2U长效胰岛素，6周后血糖明显提高，血清胰岛素明显减少。,(三)手术及药物联合制作糖尿病模型,(四)病毒诱导方法 柯萨奇病毒可使新生的小鼠、田鼠等致病，对成年鼠不致病。 选用DBA2雌性小鼠，皮下接种脑炎、心肌炎病毒Ｍ型变异株，4～7ｄ后出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺中胰岛素含量降低。,(五)自发性Ⅰ型糖尿病动物模型,1.NOD小鼠： 是JCL -ICR品系小鼠衍生的CTS(白内障易感亚系)糖尿病小鼠近亲杂交而来，其发病多突然，表现明显多饮、多尿、消瘦，血糖显著升高，不用胰岛素治疗，动物存活不了一个月，通常死于酮血症。 高果糖饮食等可预防NOD小鼠糖尿病发作。 NOD小鼠的糖尿病发病率与性别有关，雌性鼠发病率显著高于雄性鼠且发病早。,2.BB糖尿病大鼠 ： 是从Wistar大鼠中筛选出来的一种自发性、遗传性糖尿病动物模型。 发作是突然的，大约在60～120日龄时发病，数天后，糖尿病动物出现严重的高血糖,低胰岛素和酮血症。 免疫抑制剂、新生鼠胸腺切除等可预防糖尿病的发生。 由于BB鼠能模拟人类Ⅰ型糖尿病的自然发病、病程发展和转归，且没有外来因素的参与和干扰，是一种十分理想的Ⅰ型糖尿病动物模型。,3.LEW.1NR1/ztm-iddm大鼠 是Lewis大鼠MHC单倍型自发突变株,自发性自身免疫Ⅰ型糖尿病动物模型。58ｄ左右发病,发病率为20%,性别不影响发病率。特点是高血糖、糖尿、酮尿和多尿。,二、Ⅱ型糖尿病动物模型,(一)化学药物损伤1.一次性大剂量STZ注射 小鼠STZ 65mg/kg体重,可致空腹血糖明显上升 。2.多次小剂量STZ注射⑴金黄地鼠： 连续腹腔注射小剂量链脲佐菌素3天，剂量为40mg/kg，于注射后1、2、3、4、8周测动物血糖、血脂，成模。⑵大鼠： 用STZ处理的新生大鼠成年后将呈典型的Ⅱ型糖尿病表现。 自发性高血压鼠(SHR)在新生期予以STZ处理，成年可获得Ⅱ型糖尿病合并原发性高血压模型。,(二)STZ加膳食诱导的模型 少量STZ, 同时饲以高脂肪饲料, 诱导出接近人类Ⅱ型糖尿病的动物模型。1.小鼠 ： 高脂肪饲料喂养Ｃ57BL/6Ｊ雄性断乳小鼠3周，ip STZ，继续喂养4周成模。 2.大鼠： 雌性Wistar大鼠喂以高糖高脂饲料(其中含10%蔗糖,10%猪油,5%胆固醇)一个月，诱发出胰岛素抵抗，继以低剂量链菌素(STZ，25 mg/kg，ip) 2次，每周1次，诱发胰岛素代偿性分泌障碍，使之产生高血糖症，是Ⅱ型糖尿病血管并发症的理想模型。 高脂高糖饲料（蛋白质5%、碳水化合物60%其中蔗糖为30%、脂肪32%其中炼猪油为30%） 高脂饲料（在10kｇ标准饲料中加入150ｇ食盐、50ｇ白糖、2000ｇ猪油、400ｇ麻油、2000ｇ花生、鸡蛋900ｇ,碳水化合物48%,脂肪22%,蛋白质20%。）,(三)特殊膳食诱导 1.大鼠： Wistar大鼠饮用12%的果糖水，连续六个月，形成了明显的胰岛素抵抗，因此认为该模型是糖尿病实验研究的一种适用动物模型。 2.家兔： 家兔饲以高糖、高脂诱发糖尿病饲料(10%猪油、37%白蔗糖混合53%基础饲料)单笼饲养,每只动物每天约喂食100ｇ饲料,自由饮水，室温18～25℃,实验期为32周。 3.小型猪： 3～4月龄,体重6.02±1.29kg/头的贵州小型猪，雌、雄各半，饲以高脂高糖饲料(10%猪油、37%蔗糖、混合53%基础饲料)，单栏饲养,每头动物每天按体重的2.5%喂食饲料,自由饮水,室温18～25℃,实验期为6个月。成模。,(五)自发性Ⅱ型糖尿病动物模型1.KK小鼠 轻度肥胖型Ⅱ型糖尿病动物，从5周龄起,血糖、血循环中的胰岛素水平以及HbA1ｃ水平逐步升高。脂肪组织的胰岛素敏感性降低，且到16周龄时完全丧失。肾脏病变发生早,发展迅速,肾小球基底膜增厚。 2.ob/ob小鼠 Ⅱ型糖尿病动物模型，属常染色体隐性遗传。纯合体动物表现为肥胖,高血糖及高胰岛素血症。 3. db/db小鼠 属Ⅱ型糖尿病模型。动物在一个月时开始贪食及发胖,继而产生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也升高。一般在10个月内死亡。,4.NSY小鼠 近交系自发性糖尿病模型，与人的NIDDM发病机理相似。5. Zucker fa/fa大鼠 是典型的高胰岛素血症肥胖模型。 6.黑线仓鼠 俗称中国地鼠(Chinesehamster),原为我国黄河以北一些省份的优势鼠种。这种动物模型为非肥胖型,以中轻度高血糖为特征,血清胰岛素表现多样，胰岛病变程度不一，类似于人类的Ⅱ型糖尿病。 7.GK大鼠 GK大鼠也是一种自发的Ⅱ型糖尿病鼠种 8.嗜沙肥鼠,三、检测指标 (一)一般性指标  糖尿病时会导致动物摄食量、饮水量增加和血清葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、糖化血红蛋白、乳酸分泌增高,而血清胰岛素、红细胞胰岛素受体最大亲和力、糖耐量降低。测定上述指标可反映实验动物是否产生高血糖或患糖尿病。 (二)其他生化和免疫学指标 可应用ELISA测定TNF-α、INF-γ、IL-４等细胞因子和免疫球蛋白IgE（反映细胞凋亡情况）;还可测定内皮素（ET）和NO（反映氧自由基产生情况）、Ang-Ⅱ和（AT-１）mRNA（反映血管变化及间接反映氧自由基产生情况）、IGF-１即胰岛素样生长因子-１和瘦素（了解胰岛素的分泌,间接反映氧自由基情况）、AGEｓ即糖基化产物（反映体内氧化应激和糖基化反应情况）、PAH即苯丙氨酸羟化酶（反映糖异生的快慢）、GAD即谷氨酸脱羧酶抗体（该抗体阳性,表明细胞自身免疫性破坏）、胰岛素抗体（抗体阳性,说明胰岛素分泌不足）、Ｃ肽（反映胰岛β细胞的功能）等。,三、检测指标](三)病理切片及形态学检查 STZ型糖尿病可见胰腺外分泌大量灶状或散在的单核细胞,胰岛细胞空泡变性,使胰岛呈空虚状态,胰岛毛细血管扩张、充血、胰岛细胞减少。而Alloxan型糖尿病则见部分胰岛形状不规则,边缘不整齐,胰岛β细胞排列紊乱,个别胰岛只剩下几个细胞环绕在胰岛周边部分,亦可见不规则花环状等各种形态,有的胰岛内β细胞所剩无几,几乎成为空泡状,仅能辨认其轮廊。自发性糖尿病模型病理切片主要观察胰岛淋巴细胞浸润程度并进行分级评分,每只动物至少记数15个胰岛,求出胰岛炎积分（IS）。,