1、抗 Cetuximab 单克隆抗体制备及其双抗体夹心 ELISA检测方法的建立摘 要本研究利用 Cetuximab 3 次腹腔免疫 6-8 周龄 BALB/c 雌性小鼠。通过杂交瘤技术、间接 ELISA 筛选技术及腹水制备等技术制备并获得抗 Cetuximab 单克隆抗体。实验结果表明，通过细胞融合成功得到三株能稳定分泌抗 Cetuximab 单抗的杂交瘤细胞株 4C5、1F8 和 4B12，制备的腹水单克隆抗体纯化后效价为 10-6 以上，三株抗体重链均为 IgG1亚类，轻链类型均为 k 链。利用制备的单克隆抗体（Mab）建立Cetuximab 单抗双抗体夹心 ELISA 检测方法，试验结果
2、显示，该检测方法特异性良好，不与其他抗体及蛋白发生交叉反应。 关键词Cetuximab 单克隆抗体 双抗体夹心 ELISA 中图分类号：TM121.1.3 文献标识码：B 文章编号：1009-914X（2016）01-0017-01 Cetuximab 是治疗结直肠癌的一种治疗性生物制品，其能够与 EGFR 的内源性配体 EGF、TGF- 竞争性地与 EGFR 胞外配体区结合，抑制EGFR 自身磷酸化，阻断下游信号转导通路，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信号的下传，从而抑制肿瘤细胞增殖，且与抗肿瘤药物合用具有协同作用。抗 Cetuximab 单克隆抗体的制备和其双抗体检测方法的建立为开展 Cet
3、uximab 药物代谢动力学研究奠定了基础。 1、材料 佐剂购自 SIGMA 公司；西妥西单抗由哈药集团技术中心制备；68周龄 Balb/c 小鼠购自北京实验动物研究中心；SP2/0 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。 2、方法 2.1 单克隆抗体的制备 用纯化的 Cetuximab 按照萨姆布鲁克 J 等1报道的方法免疫 5 只Balb/c 小鼠，经过 3 次基础免疫，选取效价最高（10000）的小鼠进行强化免疫。34 天后利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，阳性杂交瘤筛选经过 3 次克隆，挑选获得的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆建库，阳性克隆细胞株扩大培养后注射 Balb/c 小鼠腹腔内诱生
4、腹水，利用亲和层析方法纯化所得的小鼠腹水，进行 SDS-PAGE 纯度鉴定和间接 ELISA 测定抗体效价。 2.2 双抗体夹心 ELISA 检测方法建立 2.2.1 双抗体夹心 ELISA 最佳反应条件确定：参考李瑞等（ 2005） 、焦奎等（ 2004） 方法。 2.2.2 双抗体夹心 ELISA 方法特异性：按上述 ELISA 方法对鼠血清、人血清、猴血清、曲妥珠单抗及西妥昔单抗进行检测，以检验该方法的特异性。 2.2.3 双抗体夹心 ELISA 方法的灵敏度：将浓度为 4ug/mL 的Cetuximab 连续作 4 倍梯度稀释，然后按照确定的 ELISA 反应条件进行测定。根据 P/N
5、 值大于 2.1，阳性值大于 0.2，检验该方法的灵敏性。 3、结果与分析 3.1 单抗制备：通过 Balb/c 小鼠免疫、细胞融合、间接 ELISA 筛选及细胞株克隆筛选获得 3 株稳定分泌 Cetuximab 单抗的杂交瘤细胞株4B12、1F8 和 4C5。用体内诱生腹水法分别制备 4B12、1F8 和 4C5 三株杂交瘤细胞的单克隆抗体，电泳纯度均在 95%以上（电泳结果见图 1） 。纯化后腹水抗体效价为 10-6 以上。抗体亚类鉴定结果显示，所得的单克隆抗体重链为 IgG1 亚类，轻链为 k 链。抗体特异性鉴定结果显示，抗体均能与市售西妥西单抗发生高亲和力结合，但不与鼠 IgG1 和人
6、 IgG1 发生交叉反应，说明其具有较好的特异性。 3.2 Cetuximab 单抗双抗体夹心 ELISA 方法的确定 3.2.1 包被：用碳酸盐包被液稀释纯化的 Cetuximab 单抗至浓度1g/mL，加入 96 孔酶标板，每孔 100 L，4包被过夜； 3.2.2 封闭：用 PBST 洗涤 3 次，拍干后，每孔加入 300 l 5%脱脂奶粉，37 封闭 1 h； 3.2.3 一抗浓度：PBST 洗涤 3 次，拍干后，将待检样品进行1：1000 倍稀释，Cetuximab 标准品进行 4 倍稀释（40001ng） ，每孔加入 100 L，37孵育 1h； 3.2.4 酶标二抗：将 HRP
7、标记羊抗人 IgG-Fc 抗体 1：5000 稀释，每孔加入 100 L，37孵育 1h； 3.2.5 显色时间：PBST 洗涤 3 次，拍干，加入底物液（OPD） ，室温避光作用 10min； 3.2.6 终止：每孔加入 50 L 终止液（2M H2SO4） ，轻轻振摇混匀，测定 OD492 值。 3.3 双抗体夹心 ELISA 检测方法特异性的鉴定 试验结果显示，检测样品中只有市售西妥西单抗出现强阳性反应，其他均为阴性，表明此方法特异性较好。结果见表 1。 3.4 双抗体夹心 ELISA 方法灵敏度的测定 将纯化抗原的浓度稀释到 4ug/mL，之后连续作 4 倍梯度稀释，按照确定的 ELISA 反应条件进行测定，实验结果显示，该方法能检测出约0.89ng / mL 的抗体样本，显示出良好的灵敏度。 4、讨论 ELISA 检测方法常受到反应温度、pH、时间、酶标板的质量等多种因素影响，因此有关 ELISA 的各种条件都需要进行优化。本研究对所建立的 ELISA 方法的各步缓冲液系统、溶液浓度、孵育时间等条件进行了摸索， 并最终确立反应条件。经验证，所建立的双抗体夹心 ELISA 检测方法具有良好的灵敏性和特异性，为西妥西单抗的药代动力学分析提供物质基础。 参考文献 1 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW（黄培堂，等译）.分子克隆实验指南M.北京：科学出版社，2002，
