啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc

上传人:gs****r 文档编号:1613493 上传时间:2019-03-08 格式:DOC 页数:7 大小:56KB
下载 相关 举报
啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc_第1页
第1页 / 共7页
啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc_第2页
第2页 / 共7页
啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc_第3页
第3页 / 共7页
啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc_第4页
第4页 / 共7页
啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进.doc_第5页
第5页 / 共7页
点击查看更多>>
资源描述

1、啮齿类海马神经元的原代培养及方法改进摘 要:目的:通过对新生啮齿类海马神经元的分离和培养,尝试建立一个简单、稳定、高效的啮齿类海马神经元原代培养方法,为脊髓损伤的相关分子机制研究提供目的细胞。方法:取新生 SD 乳鼠的海马组织,通过低浓度胰酶消化制成细胞悬液、4h 差速贴壁后使用无血清Neurobasal 培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫荧光对海马神经元相关微管蛋白-2(MAP2)行特异性染色,结合 DAPI 核染色鉴定神经元。结果:该方法培养的海马神经元生长状态良好,纯度较高。结论:采用低浓度胰酶消化,差速贴壁及无血清培养啮齿类海马神经元符合体外细胞实验要求,为进一步研究提供良好

2、的目的细胞。 关键词:海马神经元;低浓度胰酶;差速贴壁;无血清培养 中图分类号 Q42 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2016)02-06-03 Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons Chen Xuezhou1 et al. (1 The Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022,China) Abstract:Obej

3、ctive:To established a simple, effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro, and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods:The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low con

4、centration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope, the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results:The hippo

5、campal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion:Using low concentration of trypsin, differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro, so as to provide targeted cells for further research. Key words:Hippocampa

6、l neurons;Low concentration of trypsin;Differantial adherence;Serum-free medium 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱外科一种致残率很高的疾病,易造成患者运动功能障碍,大小便失禁甚至终身瘫痪1。现代研究表明,脊髓损伤后,经历第一次原发性损伤及第二次继发性损伤,二次损伤是继发性,是可以预防和治疗的,其重点在于保护残存神经元的功能2。建立简单、稳定、高效的神经元体外培养是在细胞水平研究脊髓损伤的重要物质基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 出生 24h 内 SD 乳鼠,雌雄不限

7、,由安徽医科大学实验动物中心提供。 1.1.2 主要试剂 Neurobasal 培养基、B27 无血清添加剂、GlutaMAX-I 添加剂、DMEM(high glucose)培养基、灭活胎牛血清、0.25%胰酶、台盼蓝染液均购自 Invitrogen 公司,多聚-D-赖氨酸、DPBS、Hanks 液、抗荧光淬变封片液购自碧云天公司,DNase I、DAPI、Triton X-100 购自 sigma 公司,神经元相关微管蛋白-2(MAP2) 、Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG(H+L)购自 abcam 公司。 1.1.3 主要器材 24 孔细胞培养板、15mm 细胞爬片、超

8、净工作台、细胞培养箱、激光共聚焦显微镜、手术解剖显微镜 1.2 方法 1.2.1 溶液配制 种植培养液:含 90%DMEM+10%灭活胎牛血清。维持培养液:98%Neurobasal 培养基+2%B27 无血清添加剂+0.5mMGlutaMAX-I添加剂。 1.2.2 细胞爬片及细胞培养孔板处理 将灭菌的 15mm 细胞爬片用DPBS 配制的 0.1mg/mL 多聚-D-赖氨酸溶液浸泡,室温孵育 2h,吸弃多聚-D-赖氨酸溶液,蒸馏水洗 2 遍,晾干待用。 1.2.3 海马神经元的分离 取出生 24h 内 SD 乳鼠,75%酒精消毒后断头,依次剪开皮肤、颅骨,迅速取出脑组织置于冰上含有预冷 H

9、anks 液的培养皿中。在手术显微镜下分离出两侧的海马区,彻底剥离脑膜及血管。用剪刀剪成约 1mm3 大小,加入预热的 0.05%胰酶,放入 37消化15min(每 7min 稍微摇晃一下) 。小心吸走消化过组织,用 2mL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基终止消化,加入 100LDNase I,混匀后使用 1mL枪头上下轻柔吹打 15 下,静置 2min,吸取上清液。再像沉淀的组织团块中加入 2mL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基及 100L DNase I,重复上述吹打步骤。吸取上层细胞悬液,如此重复 2 次。70m 细胞筛过滤,1000r/min 离心 5min 弃上清,使

10、用种植培养基重悬,吸 100L 细胞悬液后加入 100L 台盼蓝染液,于血球计数器下计数细胞,调整细胞密度至2105 个/mL,每孔加入 1mL,十字摇板数次,放入培养箱内。以上操作确保在 2h 内全部完成。4h 后使用无血清 DMEM 培养基洗板镜检细胞碎片基本去除后,换成 Neurobasal 培养基,后每 2d 半量换液。 1.2.4 神经元细胞鉴定 取体外培养 7d 的海马神经元细胞爬片,吸出培养基,PBS 洗 1 次,加入 1mL 预热多聚甲醛溶液,确保神经突不被破坏,室温孵育 10min。PBS 洗 1 次,0.1%Triton X-100 通透膜 10min。加入 10%山羊血清

11、孵育 1h 后,加入 1%血清稀释的 MAP2(1500) ,4湿盒孵育过夜。加入 1%血清稀释的 Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG(H+L) (11 000) ,室温避光孵育 1h。DAPI 复染 5min 后,将细胞爬片反转放至滴有抗荧光淬灭封固液的干净载玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封载玻片边缘,激光共聚焦显微镜观察。 2 结果与分析 2.1 细胞形态的观察 刚接种细胞分散,呈圆形透亮。4h 后细胞已贴壁,部分细胞已伸出短小轴突。12d 后,细胞明显增大,突起延伸,形成稀疏网络。在培养过程中,神经元之间的纤维联系逐渐丰富,并形成网络。57d 神经元在倒置显微镜下可见

12、具有明显的光晕,此时神经元胞体呈三角形、椭圆形或多边形,边界清楚,胞体明亮,立体感增强(图1、图 2) 。 3 讨论与结论 神经元是脑及脊髓组织中最基本的组成成分,对神经系统功能的发挥着主要的作用,是脑及脊髓损伤中最常用的细胞,其培养和鉴定技术亦是神经生物学研究中最基本的技术。但是连续的神经元细胞系因无法形成典型的轴突、树突及突触而得不到广泛应用,而原代培养的神经元比传代细胞系更加接近在体状态,是研究工作中较佳的目的细胞,得到了广泛应用。 理论上,原代神经元的培养可通过大脑任何部位及脊髓获取,但海马部位较其他部位神经细胞成分简单,含量多,拥有典型的细胞表型3-4。传统方法多采用胎鼠进行海马神经

13、元的培养5-6,其神经分化程度低,便于培养,但由于操作复杂,如进行雌雄鼠配种,计算胎龄,实验时间不可控制,取材时胎鼠表面羊水过多,海马较小等导致操作要求高。而采用乳鼠较胎鼠具有较多的优点,可按照实验按需处死一至数只实验乳鼠,取材较胎鼠简单,无需担心缺氧对胎鼠脑神经元的损害。 在海马神经元培养的过程中,很多因素都会影响原代海马神经元培养的质量,如收集细胞过少,接种时死细胞比例过高,杂细胞过多等,其对实验条件的要求较普通细胞更高。首先,除了消化以外,其他操作均在冰上操作,从解剖至接种细胞控制在 2h 内完成,尽量减少组织细胞代谢。解剖时,在手术显微镜下尽可能去除海马组织表面所有的血管膜,以免消化后

14、被迫吹打,导致接种时死细胞及杂细胞比例过高。其次,组织在消化前用剪刀剪碎,并使用低浓度 0.05%胰酶加适量 DNA 酶,作用时间控制在 15min 左右,低浓度胰酶消化能力相对温和,死细胞较少,从而避免使用木瓜酶现用现配的缺点。DNA 酶可分解消化过程死细胞释放出来的 DNA,避免组织缠结,吹打过程可收获更多单细胞悬液。吹打时,采用分步吹打,慢吸慢吹,动作轻柔,保证每一个单细胞都避免过度吹打,尽可能多地收集细胞。再次,使用含 10%灭活胎牛血清重悬、接种细胞,其血清成分可促进细胞生长、增殖,4h 后换成含 B27 添加剂的Neurobasal 培养基,换液前轻微震荡,可将多数贴壁不牢固的胶质

15、细胞及细胞碎片去除。含 B27 添加剂的 Neurobasal 培养基其成分确定,培养出的细胞状态均一,选择性促进神经细胞生长,而胶质细胞几乎不分裂。最后,接种板也是决定实验成败的关键因素,接种板密度过低,神经元突触形成过少,无法利用自身分泌促生长因子,同时胶质细胞分裂过多,难以存活和成熟。密度过高,营养相互争夺,细胞容易抱团生长,均会导致实验失败。本实验胶质细胞含量较少,未使用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长,因阿糖胞苷加入时间及剂量难以控制,毒性较大,除了抑制胶质细胞外,对正常海马神经元亦有毒害作用。 综上所述,采用低浓度胰酶消化,差速贴壁及无血清培养新生 SD 乳鼠海马神经元的方法简单、稳定、高

16、效,可得到高密度的符合体外实验要求的细胞,为神经系统损伤的研究提供了良好的目的细胞。 参考文献 1Kirchberger I,Sinnott A, Charlifue S, et al.Functioning and disability in spinal cord injury from the consumer perspective:an international qualitative study using focus groups and the ICFJ.Spinal Cord.,2010,48(8):603-613. 2Stirling DP, Yong VW.Dynami

17、cs of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometryJ.J Neurosci Res.,2008,86(9):1944-1958. 3Calabrese B, Halpain S.Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphologyJ.Neuron.,2005,48(1):77-90. 4Williams ME, Wilke SA, Daggett A, e

18、t al.Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampusJ.Neuron.,2011,71(4):640-655. 5Kaech S, Banker G.Culturing hippocampal neuronsJ.Nat Protoc.,2006,1(5):2406-2415. 6Fath T, Ke YD, Gunning P,et al.Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neuronsJ.Nat Protoc,2009,4(1):78-85. (责编:张宏民)

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 学术论文资料库 > 毕业论文

Copyright © 2018-2021 Wenke99.com All rights reserved

工信部备案号浙ICP备20026746号-2  

公安局备案号:浙公网安备33038302330469号

本站为C2C交文档易平台,即用户上传的文档直接卖给下载用户,本站只是网络服务中间平台,所有原创文档下载所得归上传人所有,若您发现上传作品侵犯了您的权利,请立刻联系网站客服并提供证据,平台将在3个工作日内予以改正。