【实验报告】血液凝固及其影响因素.doc

1、动 物 生 理 学 实 验 报 告 Page 1实验五：血液凝固及其影响因素实 验 人 ： 同 组 人 ： 【 实 验 目 的 】1 学 习 血 液 凝 固 的 基 本 过 程2 了 解 加 速 或 延 缓 血 液 凝 固 的 一 些 因 素【 实 验 原 理 】血 液 凝 固 是 一 个 酶 的 有 限 水 解 激 活 过 程 ， 在 此 过 程 中 有 多 种 凝 血 因 子 参 与 。 根 据 凝 血 过 程 起 动时 激 活 因 子 来 源 不 同 ， 可 将 血 液 凝 固 分 为 内 源 性 激 活 途 径 和 外 源 性 激 活 途 径 。 内 源 性 激 活 途 径 是 指参

2、与 血 液 凝 固 的 所 有 凝 血 因 子 在 血 浆 中 ， 外 源 性 激 活 途 径 是 指 受 损 的 组 织 中 的 组 织 因 子 进 入 血 管 后 ，与 血 管 内 的 凝 血 因 子 共 同 作 用 而 启 动 的 激 活 过 程 。【 实 验 材 料 和 用 具 】家 兔清 洁 小 试 管 7 个 、 小 烧 杯 2 个 、 竹 签 、 秒 表 、 试 管 架 、 哺 乳 动 物 手 术 器 械 一 套 、 兔 手 术 台 、 动 脉 夹 、塑 料 动 脉 插 管 、 线 、 棉 花 、 水 浴 槽 、 冰 盒液 状 石 蜡 、 肝 素 、 草 酸 钾12mg、 脑 匀

3、 浆 液 0.1ml、 生 理 盐 水【 实 验 过 程 】1、 动 物 麻 醉 及 颈 部 手 术 （ 此 部 由 助 教 老 师 操 作 ）取 一 只 动 物 ， 称 重 。 按 1g/kg 体 重 的 剂 量 将 乌 拉 坦 （ 氨 基 甲 酸 乙 酯 ） 由 耳 缘 静 脉 缓 慢 注 入 ， 观 察 动物 肌 张 力 、 呼 吸 与 角 膜 反 射 的 变 化 。 动 物 麻 醉 后 背 位 固 定 于 兔 手 术 台 上 。剪 去 颈 部 手 术 野 的 毛 ， 沿 颈 正 中 线 在 喉 头 上 一 指 至 锁 骨 上 一 指 的 地 方 作 一5 7cm 的 皮 肤 切 口 。

4、 分 离 皮下 组 织 及 肌 肉 。2、 颈 总 动 脉 插 管 （ 此 部 由 助 教 老 师 操 作 ）在 气 管 两 侧 辨 别 并 分 离 颈 总 动 脉 ， 颈 总 动 脉 下 方 穿 两 条 线 备 用 。 在 左 侧 颈 总 动 脉 的 近 心 端 夹 一动 脉 夹 ， 在 动 脉 夹 远 心 端 距 动 脉 夹 约3cm 处 结 扎 。 用 小 剪 刀 在 结 扎 线 的 近 侧 （ 结 扎 线 与 动 脉 夹 之 间 ） 沿向 心 方 向 剪 一 小 斜 口 （ 约 占 管 径 的 一 半 ） ， 向 心 脏 方 向 插 入 动 脉 插 管 ， 由 备 用 的 线 结 扎

5、固 定 。 取 血时 将 动 脉 夹 松 开 即 可 。3、 血 液 凝 固 的 加 速 和 延 缓观 察1. 打 开 兔 颈 总 动 脉 夹 ， 血 液 从 动 脉 插 管 流 出 ， 弃 去 第 一 份1mL 动 脉 血 后 ， 向 每 个 试 管 中 注 入1mL 兔动 脉 血 ， 并 摇 匀 。2. 自 血 液 流 出 动 脉 插 管 开 始 计 时 。 除 第1 管 外 ， 其 他 各 管 每 隔 15 秒 钟 将 试 管 倾 斜 一 次 ， 观 察 液 面是 否 倾 斜 即 血 液 是 否 流 动 ， 直 到 试 管 内 血 液 不 再 流 动 为 止 ， 记 录 凝 血 时 间

6、。3. 当 第 2 管 已 经 凝 固 时 ， 再 倾 斜 第1 管 看 血 液 是 否 凝 固 ， 若 尚 未 凝 固 则 按 上 述 方 法 每 隔15 秒 钟 倾 斜一 次 ， 直 到 血 液 凝 固 为 止 ， 记 录 凝 血 时 间 ， 即 为 该 兔 血 的 凝 固 时 间 。4. 以 第 2 管 为 对 照 ， 各 管 观 察 其 他 各 管 中 血 液 凝 固 时 间 。5. 向 第 9 管 中 滴 加 2 氯 化 钙 2 滴 ， 观 察 血 液 是 否 凝 固 。6. 取 出 第 5 管 中 的 玻 棒 ， 用 水 洗 净 ， 观 察 附 着 在 玻 棒 上 的 纤 维 蛋

7、白 。注 意 事 项 ：动 物 生 理 学 实 验 报 告 Page 2a) 取 放 试 管 时 要 用 拇 指 和 食 指 捏 住 试 管 的 上 端 ， 不 要 握 住 试 管 的 底 部 ， 以 免 手 的 温 度 影 响 结 果 。b) 每 支 试 管 口 径 及 采 血 量 要 尽 量 一 致 ， 不 可 相 差 太 大 。c) 记 录 凝 血 时 间 要 准 确 。d) 判 断 凝 血 的 标 准 要 前 后 一 致 。 一 般 以 倾 斜 试 管 达45时 ， 试 管 内 血 液 不 见 流 动 为 准 。【 实 验 结 果 及 相 关 讨 论 】管 号 实 验 条 件 凝 血

8、时 间（ 一 组 ） 凝 血 时 间（ 二 组 ） 现 象 解 释1 加 入 0.1 肝 素 溶 液0.1mL（ 6 滴 ） 大 于20min 大 于20min肝 素 是 抗 凝 剂 ， 能 不 可 逆 的 阻 止 血 液 凝 固 。由 于 肝 素钠 具 有 带 强 负 电 荷 的 理 化 特 性 ， 能 干 扰 血 凝 过 程的 许 多 环 节 ， 在 体 内 外 都 有 抗 凝 血 作 用 。 其 作 用机 制 比 较 复 杂 ， 主 要 通 过 与 抗 凝 血 酶 （ AT- ） 结合 ， 而 增 强 后 者 对 活 化 的 a、 a、 a、 a 和 a凝 血 因 子 的 抑 制 作 用

9、 。 其 后 果 涉 及 阻 止 血 小 板 凝集 和 破 坏 ， 妨 碍 凝 血 激 活 酶 的 形 成 ； 阻 止 凝 血 酶原 变 为 凝 血 酶 ； 抑 制 凝 血 酶 ， 从 而 妨 碍 纤 维 蛋 白原 变 成 纤 维 蛋 白 。 中 和 组 织 凝 血 活 素 （ 因 子 ） 。 抑制 血 小 板 的 聚 集 和 释 放 。 它 对 血 中 有 机 成 分 和 无机 成 分 的 测 定 均 无 影 响 。2 加 入 2 草 酸 钾 溶 液0.1mL （ 6 滴 ） 大 于20min血 液 凝 固 的 多 个 环 节 中 都 需 要 钙 离 子 的 参 与 ， 故通 常 用 枸 橼

10、 酸 钠 、 草 酸 钠 和 草 酸 钾 作 为 体 外 抗 凝剂 ， 它 们 可 与 钙 离 子 结 合 而 除 去 血 浆 中 的 钙 离 子 ，从 而 起 到 抗 凝 作 用 。 理 论 上 当 继 续 向 血 液 中 加 入CaCl2溶 液 ， CaCl2中 的 钙 离 子 会 起 到 凝 血 因 子 IV 的 作 用 ，从 而 使 再 次 启 动 凝 血 过 程 ， 血 液 凝 固 。 草 酸 盐 是可 逆 性 抗 凝 剂 。 但 本 次 实 验 中 加 入CaCl2后 并 没 有 出现 凝 血 现 象 ， 可 能 是 CaCl2溶 液 配 置 有 问 题 ， 或 者由 于 操 作

11、不 当 ， 凝 血 因 子 已 经 完 全 失 活 。3室 温 （ 6 滴 生 理 盐水 ）静 置7min30s 7min30s血 液 流 出 血 管 后 ， 很 快 会 凝 固 。 血 液 流 出 血 管 后血 小 板4室 温 （ 6 滴 生 理 盐水 ）每 隔 15S 倾 斜 454min 5min倾 斜 可 加 速 血 小 板 的 粘 附 聚 集 过 程 ， 并 加 大 血 小板 释 放 的 凝 血 因 子 与 血 细 胞 的 接 触 面 积 ， 从 而 加快 了 凝 血 的 过 程 。 该 过 程 是 内 源 性 凝 血 过 程 。5 细 玻 璃 粉 少 许 （ 6 滴生 理 盐 水

12、） 2min45s 3min 玻 璃 粉 是 异 物 ， 可 激 活 凝 血 因 子 及 血 小 板 ， 启 动凝 血 过 程 。6 脑 组 织 浸 出 液 （ 6 滴 ） 15s 30s 脑 组 织 液 中 有 组 织 因 子 途 径 抑 制 物 ， 是 外 源 性 凝血 途 径 的 特 异 性 抑 制 剂 ， 因 而 能 加 速 凝 血 过 程 。7 置 于 40 水 浴 （ 6 滴生 理 盐 水 ） 165s 165s 适 当 升 高 温 度 ， 能 增 加 酶 的 活 性 ， 加 快 凝 血 过 程 。8 置 于 10 水 浴 （ 6 滴生 理 盐 水 ） 大 于20min 降 低 温

13、 度 可 以 降 低 酶 的 活 性 ， 延 缓 凝 血 过 程 。9 竹 签 搅 拌 （ 6 滴 生 理盐 水 ） 有 富 有弹 性 的 同 上 在 竹 签 的 搅 动 下 ， 特 别 是 缠 上 线 的 接 触 面 粗 糙 的竹 签 ， 能 加 速 凝 血 过 程 ， 使 凝 血 因 子 按 一 定 顺 序动 物 生 理 学 实 验 报 告 Page 3纤 维 蛋白 纠 缠在 竹 签 上相 继 激 活 而 生 成 凝 血 酶 ， 最 终 使 纤 维 蛋 白 原 变 为纤 维蛋 白 ， 而 纠 结 在 竹 签 上 ， 形 成 一 层 蛋 白 膜 。机 体 凝 血 系 统 包 括 凝 血 和

14、抗 凝 两 个 方 面 ， 两 者 间 的 动 态 平 衡 是 正 常 机 体 维 持 体 内 血 液 流 动 状 态和 防 止 血 液 丢 失 的 关 键 。 机 体 的 正 常 止 凝 血 ， 主 要 依 赖 于 完 整 的 血 管 壁 结 构 和 功 能 ， 有 效 的 血 小 板质 量 和 数 量 ， 正 常 的 血 浆 凝 血 因 子 活 性 。 其 中 ， 血 小 板 和 凝 血 因 子 是 生 理 性 止 凝 血 的 重 要 成 分,(见 图 1)。 抗 凝系 统 不 仅 包 括 抗 凝 因 子 ， 还 包 括 纤 溶 系 统 。BT 出血时间 CFT 束臂试验 CRT 血块收缩

15、试验 BPC 血小板计数CT 凝血时间 RT 复钙时间 APTT 活化部分凝血活酶时间PT 凝血酶原时间 PF 3血小板第 3 因子 TF 组织因子 Fb 纤维蛋白TXA2血栓素 A2 5-HT5羟色胺 PK 激肽释放酶原 HMWK 高分子量激肽原图 1 正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节血 小 板 的 作 用 ：在 正 常 的 血 液 循 环 中 ， 血 小 板 并 不 与 内 皮 细 胞 表 面 或 其 他 细 胞 发 生 作 用 ， 而 是 沿 着 毛 细 血 管 内壁 排 列 ， 维 持 其 完 整 性 ， 血 管 局 部 受 损 伤 时 ， 血 小 板 的 止 血 兼 有

16、机 械 性 的 堵塞 伤 口 和 生 物 化 学 性 粘 附 聚 集 作用 。 止 血 时 ， 首 先 是 受 损 的 血 管 壁 发 生 收 缩 ， 使 局 部 血 液 流 动 变 慢 或 减 少 。 血 液 中 的 血 小 板 在vWF 因 子 存 在下 迅 速 粘 附 于 暴 露 的 胶 原 纤 维 ， 此 时 血 小 板 被 激 活 ， 血 小 板 形 态 发 生 改 变 ， 由 正 常 的 圆 盘 状 态 变 为圆 球 形 ， 伪 足 突 起 ， 血 小 板 发 生 聚 集(血 小 板 膜 糖 蛋 白 IIb/IIIa 由 纤 维 蛋 白 原 介 导 发 生 互 相 粘 附 、 聚

17、集)， 此 为 血小 板 第 一 相 聚 集 ， 激 活 的 血 小 板 便 发 生 释 放 反 应 和 花 生 四 烯 酸 代 谢 ， 其 中 许 多 物 质 ， 如 血 小 板 的ADP 等 ， 可加 速 血 小 板 的 聚 集 、 变 性 成 为 不 可 逆 的“第 二 相 聚 集 ”， 形 成 白 色 血 栓 ， 构 成 了 初 期 止 血 的 屏 障 。 与 此 同时 ， 由 血 小 释 放 和 激 活 许 多 促 凝 物 质 参 与 血 液 凝 固 反 应 。 血 小 板 膜 磷 脂 表 面 提 供 了 凝 血 反 应 的 场 所 ， 血 小 板 第3 因 子 在 凝 血 过 程

18、多 个 环 节 中 发 挥 重 要 作 用 ， 血 小 板 合 成 释 放 的TXA2 和 5-HT 促 使 进 一 步 收 缩 ， 血 小 板 收缩 蛋 白 则 最 终 可 使 纤 维 蛋 白 收 缩(血 块 收 缩 )， 使 血 栓 更 为 坚 固 ， 止 血 更 加 彻 底 。凝 血 过 程 ：动 物 生 理 学 实 验 报 告 Page 4血 液 凝 固 简 称 凝 血 ， 是 血 液 由 流 动 状 态 变 为 凝 胶 状 态 的 过 程 ， 它 是 止 血 功 能 的 重 要 组 成 部 分 。凝 血 过 程是 一 系 列 凝 血 因 子 被 相 继 酶 解 激 活 的 过 程 ，

19、 最 终 生 成 凝 血 酶 ， 形 成 纤 维 蛋 白 凝 块 。 迄 今 为止 ， 参 与 凝 血 的 因子 共 有 14 个 。 其 中 用 罗 马 数 字 编 号 的 有12 个 (从 ， 其 中 因 子 并 不 存 在 )。 习 惯 上 ， 前 4 个 凝 血 因 子 常分 别 称 为 纤 维 蛋 白 原(因 子 )、 凝 血 酶 (因 子 )、 组 织 因 子 (因 子 )和 钙 离 子 (因 子 )。 凝 血 因 子 VI 已 知 是 血清 中 活 化 的 凝 血 因 子 V， 故 不 再 视 为 一 独 立 的 凝 血 因 子。1 内 源 性 凝 血 途 径内 源 性 凝 血

20、途 径 是 指 参 加 的 凝 血 因 子 全 部 来 自 血 液(内 源 性 )。 临 床 上 常 以 活 化 部 分 凝 血 活 酶 时 间(APTT)来反 映 体 内 内 源 性 凝 血 途 径 的 状 况 。 内 源 性 凝 血 途 径 是 指 从 因 子 激 活 ， 到 因 子 X 激 活 的 过 程 。 当 血 管 壁 发 生损 伤 ， 内 皮 下 组 织 暴 露 ， 带 负 电 荷 的 内 皮 下 胶 原 纤 维 与 凝 血 因 子 接 触 ， 因 子 即 与 之 结 合 ， 在 HK 和 PK 的 参与 下 被 活 化 为 a。 在 不 依 赖 钙 离 子 的 条 件 下 ，

21、因 子 a 将 因 子 激 活 。 在 钙 离 子 的 存 在 下 ， 活 化 的 a 又 激 活了 因 子 。 单 独 的 a 激 活 因 子 X 的 效 力 相 当 低 ， 它 要 与 a 结 合 形 成 1： 1 的 复 合 物 ， 又 称 为 因 子 X 酶 复 合物 。 这 一 反 应 还 必 须 有 Ca2+和 PL 共 同 参 与 。2 外 源 性 凝 血 途 径外 源 性 凝 血 途 径 ： 是 指 参 加 的 凝 血 因 子 并 非 全 部 存 在 于 血 液 中 ， 还 有 外 来 的 凝 血 因 子 参 与 止 血 。这 一 过 程 是 从 组 织 因 子 暴 露 于 血

22、 液 而 启 动 ， 到 因 子 被 激 活 的 过 程 。 临 床 上 以 凝 血 酶 原 时 间 测 定 来 反 映 外源 性 凝 血 途 径 的 状 况 。 组 织 因 子 是 存 在 于 多 种 细 胞 质 膜 中 的 一 种 特 异 性 跨 膜 蛋 白 。 当 组 织 损 伤 后 ，释 放 该 因 子 ， 在 钙 离 子 的 参 与 下 ， 它 与 因 子 一 起 形 成 1： 1 复 合 物 。 一 般 认 为 ， 单 独 的 因 子 或 组 织 因 子 均无 促 凝 活 性 。 但 因 子 与 组 织 因 子 结 合 会 很 快 被 活 化 的 因 子 激 活 为 a， 从 而

23、形 成 a 组 织 因 子 复 合 物 ， 后者 比 a 单 独 激 活 因 子 增 强 16000 倍 。 外 源 性 凝 血 所 需 的 时 间 短 ， 反 应 迅 速 。 外 源 性 凝 血 途 径 主 要 受组 织 因 子 途 径 抑 制 物(TFPI)调 节 。 TFPI 是 存 在 于 正 常 人 血 浆 及 血 小 板 和 血 管 内 皮 细 胞 中 的 一 种 糖 蛋 白 。它 通 过 与 因 子 a 或 因 子 a-组 织 因 子 -因 子 a 结 合 形 成 复 合 物 来 抑 制 因 子 a 或 因 子 a-组 织 因 子 的 活 性 。另 外 ， 研 究 表 明 ， 内

24、 源 凝 血 和 外 源 凝 血 途 径 可 以 相 互 活 化 。3 凝 血 的 共 同 途 径从 因 子 X 被 激 活 至 纤 维 蛋 白 形 成 ， 是 内 源 、 外 源 凝 血 的 共 同 凝 血 途 径 。 主 要 包 括 凝 血 酶 生 成 和纤 维 蛋 白 形 成 两 个 阶 段 。(1) 凝 血 酶 的 生 成 ： 即 因 子 a、 因 子 a 在 钙 离 子 和 磷 脂 膜 的 存 在 下 组 成 凝 血 酶 原 复 合 物 ， 即 凝 血活 酶 ， 将 凝 血 酶 原 转 变 为 凝 血 酶 。(2) 纤 维 蛋 白 形 成 ： 纤 维 蛋 白 原 被 凝 血 酶 酶

25、解 为 纤 维 蛋 白 单 体 ， 并 交 联 形 成 稳 定 的 纤 维 蛋 白 凝 块 ，这 一 过 程 可 分 为 三 个 阶 段 ， 纤 维 蛋 白 单 体 的 生 成 ， 纤 维 蛋 白 单 体 的 聚 合 ， 纤 维 蛋 白 的 交 联 。 纤 维 蛋白 原 含 有 三 对 多 肽 链 ， 其 中 纤 维 蛋 白 肽A(FPA)和 B(FPB)带 较 多 负 电 荷 ， 凝 血 酶 将 带 负 电 荷 多 的 纤 维 蛋 白 肽A和 肽 B 水 解 后 除 去 ， 转 变 成 纤 维 蛋 白 单 体 。 从 纤 维 蛋 白 分 子 中 释 放 出 的FPA 和 FPB 可 以 反

26、映 凝 血 酶 的 活 化程 度 ， 因 此 FPA 和 FPB 的 浓 度 测 定 也 可 用 于 临 床 高 凝 状 态 的 预 测 。 纤 维 蛋 白 单 体 生 成 后 ， 即 以 非 共 价键 结 合 ， 形 成 能 溶 于 尿 素 或 氯 醋 酸 中 的 纤 维 蛋 白 多 聚 体 ， 又 称 为 可 溶 性 纤 维 蛋 白 。 纤 维 蛋 白 生 成 后 ，可 促 使 凝 血 酶 对 因 子 的 激 活 ， 在 a 与 钙 离 子 的 参 与 下 ， 相 邻 的 纤 维 蛋 白 发 生 快 速 共 价 交 联 ， 形成 不 溶 的 稳 定 的 纤 维 蛋 白 凝 块 。 纤 维

27、蛋 白 与 凝 血 酶 有 高 亲 和 力 ， 因 此 纤 维 蛋 白 生 成 后 即 能 吸 附 凝 血酶 ， 这 样 不 仅 有 助 于 局 部 血 凝 块 的 形 成 ， 而 且 可 以 避 免 凝 血 酶 向 循 环 中 扩 散 。在 凝 血 共 同 途 径 中 有 两 步 重 要 的 正 反 馈 反 应 ， 有 效 地 放 大 了 内 外 源 凝 血 途 径 的 作 用 。一 是 Xa 形 成 后 ， 可 反 馈 激 活 因 子 、 、 、 ；二 是 凝 血 酶 形 成 后 ， 可 反 馈 激 活 因 子 、 、 、 、 、 以 及 凝 血 酶 原 。 凝 血 酶 还 可 促 使 血

28、 小 板 发生 聚 集 和 释 放 反 应 ， 刺 激 血 小 板 收 缩 蛋 白 引 起 血 块 退 缩 。 但 大 量 凝 血 的 产 生 却 反 过 来 破 坏 因 子 、 和 因 子 ，这 是 正 常 凝 血 的 负 反 馈 调 节 ， 以 防 止 不 适 当 的 过 度 凝 血 。抗 凝 剂 的 选 择 ：（ 1） 草 酸 钾 ： 常 用 于 尿 素 、 肌 酐 、 纤 维 蛋 白 原 等 测 定 ， 不 能 用 钾 、 钙 等 测 定 ， 对LDH、 丙 酮 酸 激 酶 、 AKP 和淀 粉 酶 有 抑 制 作 用 。动 物 生 理 学 实 验 报 告 Page 5（ 2） 肝 素

29、 ： 常 用 于 电 解 质 、 血 气 分 析 、 血 氨 等 测 定 。 抗 凝 剂 比 例 为50 61u 肝 素 /5ml 血 。 注 意 钠 盐 可 使 淀粉酶 升 高 。（ 3） 氟 化 钠 ： 常 用 氟 化 钠草 酸 钠 混 合 抗 凝 剂 作 血 糖 测 定 的 抗 凝 剂 ， 氟 化 钠 可 以 抑 止 烯 醇 化 酶 ， 它 可避 免 血 细 胞 葡 萄 糖 酵 解 酶 的 作 用 ， 延 长 标 本 的 保 存 时 间 。（ 4） 二 乙 胺 四 乙 酸 钠 盐 （EDTA-Na2） ： 生 化 常 用 的 抗 凝 剂 ， 但 不 能 用 于 钙 、 钠 、 及 含 氮

30、 物 质 的 测 定 ，对 淀 粉 酶 、 肌 酸 激 酶 、AKP、 ALP、 5-核 苷 酸 酶 等 可 抑 制 ， 对 丙 酮 酸 激 酶 有 明 显 升 高 的 作 用 。（ 5） 枸 橼 酸 钠 ， 测 定 血 沉 用 3.8%枸 橼 酸 钠 抗 凝 ， 抗 凝 剂 与 血 液 比 例 为1： 4， 凝 血 试 验 需 用 3.2%枸 橼 酸 钠 抗凝 ， 比 例 为 1： 9。（ 6） 实 验 室 使 用 抗 凝 剂 种 类 较 多 ， 血 细 胞 分 析 及 红 细 胞 比 积 测 定 宜 用EDTAK2 抗 凝 ， 保 证 室 温 下 6 小 时RBC 体 积 不 变 ， 抗 凝 剂 比 例 为1.0 2.0mg/1ml 血 。【 参 考 文 献 】生 理 学 姚 泰 人 民 卫 生 出 版 社动 物 生 理 学 实 验 魏 香 清 华 大 学 出 版 社