1、十五、生物技术药物分析,1、概念：2、分类 ,生物技术药物,重组DNA药物重组蛋白质药物,采用DNA重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物。,1、重组蛋白质或重组多肽药物包括： 细胞因子类：rIFN、IL-2、EPO等； 抗细胞素治疗：CD4可溶性受体等； 重组溶血栓类：rSK、rSAK等； 人源化单克隆抗体制剂； 重组疫苗和菌苗制剂。,2、重组DNA药物包括：寡核苷酸药物：反义核酸等；基因药物：腺病毒-IL-2、腺相关病毒-凝血因子；腺病毒- P53细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞 DNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等。,生物技术药物的质量控制与传统生产方法所得产品有本质的
2、差别。可能会含有用传统生产方法不可能存在的有害杂质。例如在细菌中表达的产品可能有内毒素、致敏原，在动物细胞中表达的产品可能有DNA杂质和病毒。,重组产品质量控制上存在的难点,建立重组药物的生物学活性测定方法；理化测定标准品的稳定性；人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；DNA疫苗的安全性和效力检测方法研究；干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定） 。,生物技术药物的质量控制,生物技术药物的特点：1、来
3、源：活的生物体（细菌或细胞）；2、结构：复杂（包括组成、空间结构）；3、生产：涉及生物材料和生物学过程（发 酵、细胞培养，分离纯化等）， 有其固有的易变性。,生物技术药物的质量控制,质量控制包括两个方面：1、生产过程中质量控制GMP（硬件、软件）2、最终目标产品的质量控制（方法学研究）,质量控制方法学研究具体内容,一、结构鉴定和确证二、生物学活性测定和比活性三、蛋白质纯度检查四、蛋白质含量测定五、蛋白质药物理化性质的鉴定六、残余杂质检查,一、鉴定,采用适宜的技术鉴定生物技术原料药或制剂的物理化学性质、生物活性、免疫化学性质、纯度和杂质。,1、氨基酸序列,预期产品的氨基酸序列测定在很大程度上可应
4、用如(b)(e)款项中提到的测定方法，随后与预期产品基因推导的氨基酸序列进行比较。,2、氨基酸组成,氨基酸组成是先用各种水解及微量氨基酸自动分析仪测定，然后再与产品基因推导的氨基酸组成进行对比。在大部分情况下，氨基酸组成分析对多肽和小分子蛋白质可提供某些有用的结构资料，但对大分子蛋白很难确定。在大多数情况下，氨基酸定量分析也可用于确定蛋白质含量。,3、N末端和C末端氨基酸测序,末端氨基酸序列分析是用以鉴别多肽或蛋白质的氨基端和羧基端的性质及均一性。作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定N-末端15个氨基酸、C-末端13氨基酸。如发现预期产品的氨基酸末端是异质的，应用适宜分析方法测定
5、变异体的相对含量。,4、肽图,用酶或化学物选择性地将产品切成片段，切成的片段用HPLC、SDS-PAGE电泳法、质谱法测定。验证的方法测得的原料药或制剂的肽图，可作为批检验中确证预期产品结构的方法。,5、巯基和二硫键,二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，发生错误配对，不但活性降低而且会引起抗原性增加。根据预期产品基因序列推导出半肮氨酸残基，采用肽图制备(还原和不还原情况下)、质谱或其他适宜的技术，测定游离SH基和/或二硫键的数目和位置。,评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影响。每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类
6、型，通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。,6、糖结构,对于糖蛋白，要测定糖含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。另外，应尽可能分析多肽链的糖链结构、寡糖类型(触角形状)和糖基化位点。,二、生物学活性测定和比活性,1、意义：1）生物技术产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成的活性中心所决定的，与其绝对质量不一致。2）生物技术产品的生物学活性与药效学基本相一致。3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要
7、手段。,有效的效价测定是生物技术原料药和/或制剂规范的组成部分。当原料药采用一种效价测定方法时，其制剂可用另一种方法(物理化学的和/或生物学的)测定。但应提供选择方法的依据。,效价测定一般原则:1、国际通用方法；2、测定结果须用国际或国家标准品校正，以国际单位表示。,生物学活性测定方法分类,1）体外细胞培养测定法 a、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60） b、抑制细胞生长作用 (TNF:L929) c、间接保护细胞作用 (IFN:VISH;VSV)2）离体动物器官测定法 采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。3）体内测定法4）生化酶促反应测定法5）免疫学活性测定法,利用动物体内某些
8、指标变化，定出产品的单位，如EPO活性测定，体内注射EPO后，计算小鼠网织红细胞增加的数量与标准品比较，确定其活性单位。,基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应为原理设计，具有简便、精确、稳定等特点，如重组链激酶、葡激酶生物活性测定，链激酶、葡激酶和纤溶酶原（h-plg）结合形成复合物激活游离h-plg原为有活性的纤溶酶。,利用制品免疫原性，制备相应单克隆抗体或多克隆抗体，采取 ELISA 法测定其含量。,生物学活性测定方法选择,体内测定和体外测定方法: a、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择
9、体外测定方法。 b、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。,生物学活性测定方法选择,2、定量、半定量、定性方法 a、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量-反应曲线；其次考虑半定量方法（如NGF），最后考虑定性（如BMP）方法。 b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用HPLC定量方法代替复杂生物活性测定方法）。,细胞培养法中细胞染色标记方法,3H-thy
10、midine、BrdU 是反映DNA合成、增殖细胞数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗体发生反应。 MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物MTT formazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测定MTT formazan的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接表示细胞的生长状态。,Alamar Blue：氧化型Alamar Blue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深
11、浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。 Crystal violet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。,几种细胞培养测定方法比较 3H-thymidine BrdU MTT Alamar Blue靶向物 DNA合成系统 线粒体电子传递系统检出细胞的状态 增殖 增殖、生存检出法 放射活性 色素、荧光 色素 色素、荧光抽出的必要性 + + + -其他试剂的必要性 + + + -成本（以MTT为1时）60 80-100（试剂盒） 1 2缺点 使用同位素 不适合 检出大量未增殖 检出未增 浮游细胞 细胞，处理时费力 殖活细胞,生物学活性测定分析方法,1
12、、用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。 2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。,活性标准品,待测样品,稀释度,a b,A值,生物学测定基本模式图,蛋白质药物的比活性测定的意义,1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。4、比活性是重组蛋白质药物
13、不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。,生物活性测定标准范围确定,1、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。2、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。,不同生物活性测定方法的规定标准表 测定方法 规定标准动物基础的生物活性测定 70%130%标示量细胞基础的生物活性测定 80%120%标示量体外酶法的生物活性测定 85%115%标示量受体结合的生物活性测定 85%115%标示量,生物学活性效价测定过程
14、中标准品的作用,1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。,物理化学方法取代生物方法的条件,产品的物理化学方法数据较完善，并已证实其高级结构。 物理化学与生物试验之间的关系亦已阐明。 工厂已积累了足够数据，可用物理方法取代。 当产品仅用物理化学方法表示生物活性，结果应用重量表示。 产品出厂检定，工厂可合理选择定量方法（生物测定还是物理化学鉴定）,三、蛋白质纯度检查,生物技术原料药和制剂的绝对纯度难以测得，并且所得结果与所用方法有关。原料药和制剂的纯度一般是用几种方法合并估计的。分
15、析方法的选择和优化主要应考虑的因素是预期产品与产品相关物质和产品杂质的分离。,由于生物技术产品及生物制品的分子特征和独特的生物合成过程，产品可含有几种分子实体或变异体。如这些分子实体来源于所预期的翻译后修饰品，则应作为预期产品的一部分。预期产品在生产和/或储存过程中形成的变异体，如其性质与预期产品相似，应作为产品相关物质，而不是杂质。对于批检验，只需选用一部分适用的方法并阐明其纯度测定的合理性。,按WHO规定必须用HPLC和非还原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应达到95%以上，有的甚至要求达到99%以上。纯度的检查通常是在原液中进行。方法：非还原SDS-PAGE电泳法、HPLC法、毛细
16、管电泳。,（1）非还原SDS-PAGE电泳法： 1）银染加样量5ug （110ng） 2）考马斯亮蓝R-250 加样量10ug （100ng） 结 果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的95%或98%。蛋白质样品在荷质比均一。,（2）HPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与SDS-PAGE原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。 （3）毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。,几种检定重组蛋白纯度方法的比较特性 HPLC SDS-PAGE、IEF CE分离机制 极性、非极性分配， 电荷、等电点 电荷等 分子大小、离子交换 分析所需时间
17、10120min 几小时 1030min 分辨力 好 好 好样品体积 1050ul 150ul 150nl 灵敏度范围 ng ug ngug pg 定量准确性 + +分析方式 紫外、荧光、折射 紫外（可见、荧光） 同HPLC 电化学、放射性 银染、放射自显影仪器价格 中高 低 中高日常消耗 低 高 低自动化 中高 低 中高人力操作 低 高 低制备级 中 中 微量级制备收集样品 可以 可以 较困难,用于研究蛋白质纯度的方法和机制 方法 分析机制 反相HPLC 疏水性 疏水性相互作用HPLC 疏水性 毛细管电泳 荷质比 离子交换HPLC 电荷 等电聚焦 电荷 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电荷比 SDS聚丙
18、烯酰胺凝胶电泳 电荷，分子大小 分子排阻HPLC 分子大小 质谱测量法 分子大小,四、蛋白质含量测定,一般采用蛋白质的含量测定。在产品以效价表示时，不必另测含量。有时还要证明所得量值直接与生物测定值相关。如已证实相关性，在生产过程中可测定含量而不测定生物活性。,可根据物理化学性质采用Folin-酚试剂法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、双缩脲法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮等方法。,Folin-酚试剂法：磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正相关。灵敏范围：5100ug/ml；优 点：简便、
19、灵敏度较高；不同蛋白质间的变异少；缺 点：受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定。,Bradford法是采用考马斯亮蓝-G250与蛋白质结合的原理，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法；灵敏范围：25200ug/ul，需要时间：10min。,紫外吸收法:蛋白质分子中常含有酪氨酸(275nm)、色氨酸(280nm)、苯丙氨酸(257nm)等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。灵敏范围：0.22mg/ml简单、省时受光吸收物质影响蛋白浓度（mg/ml）1.55A280-0.76A260,蛋白质常用的定量方法的
20、比较方法 所需蛋白质 破坏 蛋白质/蛋白 技术 方法的变异 的量（mg/ml） 与否 质变化情况 复杂性 系数（%）双缩脲 0.55 是 少 简单、快速 5Lowry 0.055 是 中等 显色慢、试剂多 5凯氏定氮 0.053 是 少 干扰、复杂、慢 0.154紫外吸收法 0.052 否 大 简单、快速、 0.439（280nm） 干扰物质多染料结合法 0.010.05 是 中等 简单、快速 3.75荧光法 0.0010.01 否 中等 较易 3.75,五、蛋白质药物理化性质的鉴定,分子量及分子大小异构体消光系数(克分子吸收系数)电泳图谱液相色谱图光谱图等电点测定,1、分子量及分子大小测定,
21、还原型SDS-PAGE：蛋白质在SDS和-巯基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面带大量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其相对分子质量相关。凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性状进行测定。质谱法：根据荷质比进测定。,2、异构体,用等电聚焦或其他适宜的技术（反相色谱）测定。,3、消光系数(克分子吸收系数),一般应在特定的紫外/可见光波长(如280nm)条件下测定预期产品的消光系数。消光系数是用已知蛋白质量(用氨基酸组分分析或定氮法测得)的产品溶液，用紫外/可见分光光度计测定。如产品用紫外/可见分光光度测定其蛋白质含量，则必须采用消光系数法。,4、电
22、泳图谱,产品的电泳图及其鉴别，可用聚丙烯胺凝胶电泳、等电聚焦、SDS聚丙烯胺凝胶电泳、Western Blot、毛细管电泳或其他适宜的方法测得。,5、液相色谱图,产品的色谱图及产品的鉴别、同质性和纯度的资料，可用分子排阻色谱、反向液相色谱、离子交换液相色谱、亲和层析或其他适宜的技术方法测定。,6、光谱图,可测定产品的紫外吸收光谱。对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的。在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱应当一致。重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光谱测定。,对于产品的高级结构需用圆二色性、磁共振和其他适宜的技术测定。,7、等电点测定,重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，但
23、在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以说明其生产工艺的稳定性。方法：等电聚焦电泳法(IEF) 毛细管电泳法。,六、免疫化学性质,当产品是抗体时，对其免疫性质应全面鉴定。用抗体与纯化抗原和抗原特定区结合试验来确定亲和力、亲和性和免疫反应性(包括交叉反应性)。如条件许可，应用生化方法确定抗原表位和带有相关抗原表位的靶分子。对于有些原料药和制剂，需用抗体识别蛋白分子不同表位的免疫化学方法(如ELISA，Western Blot)检测蛋白分子蛋白质的免疫化学性质可用于鉴别、均一性或纯度测定，也可用于定量。,工艺相关杂质是指生产过程中产生的杂质，如细胞基质(宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA)、细胞培养物
24、(诱导剂、抗生素或培养基成分)或下游工序产生的杂质。,七、残余杂质检测,1、对残余杂质进行限制的意义 a、残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题； b、可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质； c、反映产品生产工艺的稳定性。,2、生产工艺相关杂质和污染物,宿主细胞蛋白含量宿主细胞DNAIgG含量（10ng/剂量）蛋白A含量小牛血清残留量残余抗生素（氨苄西林）内毒素含量（LAL）污染物,（1）宿主细胞蛋白含量,以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用斑点免疫。常采用5种最常用的E.coli菌株混和作为ELISA测菌体蛋白含量的通用标准。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。 来自E.coli菌
25、株的产品为不大于0.1%；来自CHO细胞的产品为不大于0.05%。,（2）宿主细胞DNA,测定方法：采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNA标准品。现行生物制品规程对宿主细胞DNA残留量标准作了相应调整： 由小于100pg/剂量调整为小于10ng/剂量。宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素不作为一种危险因素。,（3）污染物,产品污染物是指带入的外源性物质而不是生产工艺的一部分，如化学及生化物质(微生物蛋白酶)和/或微生物。应严格避免污染物，并用合适的认可标准或内控限值来控制其限度。外源性病毒和支原体污染。,产品相
26、关杂质(如前体、某些降解产物)是在生产和/或贮存过程中产生的分子变异体，这些变异体在活性、有效性及安全性方面与预期产品相比，不占主导地位。,3、产品有关杂质,截短式（Truncated forms），蛋白质/多肽中失去氨基酸或内部裂解。 去酰胺化，异构化，SS链误联，氧化形式等。 聚合类杂质，包括双聚体、多聚体。,八、安全性及其他检测项目,无菌试验热源试验异常毒性试验免疫原性检查水分、装量、pH检测,几种生物技术药物检验项目表,几种生物技术药物检验项目表,几种生物技术药物检验项目表,几种生物技术药物检验项目表,由免疫细胞及非免疫细胞 经刺激而合成、分泌的一类具有多 种生物活性的小分子蛋白质,第
27、二节、细胞因子（Cytokine）,已批准上市的细胞因子生物技术药物,细胞因子的来源,活化的免疫细胞：淋巴细胞尤其是T细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。基质细胞类：血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、中枢神经系统的小胶质细胞等。某些肿瘤细胞。,二、细胞因子的共同特性,（一）结构特点:*属低分子量（6-60kD）的多肽或糖蛋白*分型：分泌型和跨膜型（TNF；TGF-；SCF）*存在形式：单体(IL-1,2等)；二聚体（IL-5，12）；三聚体（TNF)。,功能：与调节免疫应答、造血功能和炎症反应有关。作用方式:自分泌、旁分泌和内分泌；,76,CKs的共同特性及作用特点：1）高效性：
28、靶细胞-受体；高亲和力结合2）分泌性： 旁分泌、自分泌、内分泌；短时自限3）多效性： 一CK多靶多效4）重叠性： 多CK一靶一效5）协同性： 一CK强化它CK6）拮抗性： 一CK抑制它CK7）网络性： 多CK互相平衡8）同源性和多源性,多效性,重叠性,协同,拮抗,Cascade induction,网络性,NK1+T,IL- 4,骨髓基质细胞,IL-1 IL-6 IL-7 SCF,造血干细胞,IL-1 IL-6 IL-11 TNF-a GM-CSF G-CMF M-CSF,单核细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,IL-1 IL-8 TNF-a,IL-1 TNF-a,IL-10 IL- 4,IL-
29、4 IL-6,IL-10 IL-13 IL-4 TGF-b,IL-4 IL-5 IL-6 IL-13 IL-10 TGF-b,IL-4,IL-4,内皮细胞,IL-4,IL-4,IL-2 IFN-g,IL-10 IL-13 IL-4,NK 细胞,IFN-g,IL-2,IL-2 IFN-g,IL-2,IL-2 IL-12,G-CMF IFN-g GM-CSF,IL-12,IL-1 TNF-a TGF-b PDGF FGF,M-CSF GM-CSF,内皮细胞,纤维母细胞,下 丘 脑,IL-1 TNF-a,M-CSF GM-CSF,IL-1 IL-6 TNF-a,IL- 4,IL- 6,IL- 4,三
30、 细胞因子的功能分类,干扰素(Interferon, IFN)白细胞介素(interleukin, IL)集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)生长因子(Growth factor, GF)趋化因子(chemokine CK),一、干扰素（interferon; IFN）,干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，通过刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。 根据分子结构和抗原性
31、的差异分为、等4个类型。,现状,目前可供临床选用的干扰素种类很多。例如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口的干扰能（IFN2b）、干扰素（ IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。,干扰素生产工艺路线（1）,体外诱生干扰素制备工艺： Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市产量低：1g IFN，需要 3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性,干扰素生产工艺路线（2）,人源转化细胞系培养生产工艺： 1999年：IFN -n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点：首次实现大规模商业化生产。
32、 缺点： 活性低，退出临床应用。,干扰素生产工艺路线（3）,上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:,干扰素生产工艺路线（4）,上市产品：rhuIFN -1a1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono)表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku工艺特
33、点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格,动物无限细胞系培养生产工艺：,干扰素生产工艺路线（5）,宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida）上市产品：IFN -2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析,基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺:,半成品检定,（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。（2）蛋白质含量测定 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。（3）比活性
34、效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。（4）纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。,（5）相对分子量测定 还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。（6）残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。（7）残余血清IgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。（8）残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生素活性存在。,（9
35、）紫外光谱扫描 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在2802纳米。（10）肽图测定 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。（11）等电点测定 等电聚焦电泳。（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。,成品检定,（1）物理性状 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。（2）鉴别试验 应用ELISA或中和试验检定。（3）水分测定 用卡氏法，应低于3%。（4）无菌试验 同半成品。,（5）热原质试验 同半成品检定。（6）干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。（7）安全试验 取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。,
