1、ACMG 全外显子测序指南摘要：美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）以前为序列突变的解释提供了指导.1 在过去十年中，随着高通量测序的出现，测序技术迅速发展。通过采用和利用下一代测序，临床实验室正在进行基因分型，单基因，基因组，外显子，基因组，转录组和遗传疾病表观遗传学检测的不断增加的遗传检测目录。由于复杂性增加，基因检测的这种转变伴随着序列解释的新挑战。在这方面，ACMG 于 2013 年召集了一个由 ACMG，分子病理学协会（AMP）和美国病理学家学会的代表组成的工作组，重新审视和修订了序列突变解释的标准和准则。该组由临床实验室主任和临床医生组成。本报告代表 ACMG，AMP 和美国病
2、理学家利益相关者联盟组成的工作组的专家意见。这些建议主要适用于临床实验室使用的遗传检测的范围，包括基因分型，单基因，panel，外显子和基因组。本报告建议使用具体的标准术语 - “致病性”， “可能致病性”， “不确定性意义”， “可能良性”和“良性”来描述在导致孟德尔病症的基因中鉴定的突变。此外，该建议描述了基于使用典型类型的突变证据（例如，群体数据，计算数据，功能数据，分离数据）的标准将突变分类为这五个类别的过程。由于本报告中描述的临床基因检测的分析和解释的复杂性增加，ACMG 强烈建议临床分子遗传学检测应在经过临床实验室改进修订批准的实验室进行，结果由相关职业认证的临床分子遗传学家或分子
3、遗传病理学家或同等学科专家进行解释。关键词：ACMG 实验室指导; 临床遗传检测; 解释；报告 ; 序列变异术语；突变报告前言临床分子实验室正在不断增加检测的新的序列突变，因为在检测患者标本时不断发现大量与基因疾病相关的基因。 虽然一些表型与单个基因相关，但许多与多个基因相关。 我们对任何给定序列突变的临床意义的理解是循序渐进的，其范围从那些几乎肯定是疾病致病性突变到几乎肯定是良性的突变。 虽然以前的美国医学遗传学和基因组学会（ACMG）的建议提供了序列突变的解释类别和解释算法，但是这些建议没有提供定义的术语或详细的突变分类指南 .1。本报告描述了关于序列变异分类的更新的标准和指南，由专家意见
4、和经验数据确定的标准。方法在 2013 年，由 ACMG，分子病理学协会（AMP ）和美国病理学家学会成员组成的工作组成立，代表临床实验室主任和临床医生，目的是制定使用标准术语的建议，以使用根据通过专家意见，工作组共识和社会投入制定的制度对现有证据加权。为了评估临床实验室的意见，调查发送到 GeneTests.org 中列出的美国和加拿大的 100 多个测序实验室，要求输入术语偏好和评估变异分类的证据。实验室检测经验包括罕见疾病以及药物基因组学和体细胞癌检测。旨在评估术语偏好的第一项调查于 2013 年 2 月发布，结果在 2013 年 ACMG 年度会议的公开论坛上发布，其中包括 75 位与
5、会者。调查对象在北美代表了超过 45个实验室。 调查结果和公开论坛表明， （i）使用 “致病性”， “可能致病性”， “不确定性意义”， “可能良性”和“良性”这五个术语系统是首选的，已经在大多数实验室使用，以及（ii）工作组的首次努力应着重于孟德尔病和线粒体突变。在第一次调查中，实验室也被要求提供突变评估方案，11 个人分享了他们的方法。通过分析所有提交的协议，工作组制定了一套标准来加权突变证据和一套组合标准以达到五个分类层之一的规则。工作组成员使用已知类别的突变在其实验室和/或更广泛的范围检测了该方案数周。此外，对具有最常见类型证据的突变的典型示例进行了分类分配，以确保系统根据工作组成员当
6、前应用的方法对这些突变进行分类。第二次调查于 2013 年 8 月发送给那些相同的通过GeneTests 确认的实验室，以及通过 AMP 的约 2,000 个成员，以及提出的分类方案和详细的补充描述如何使用每个标准的实验室。实验室被要求使用该方案，并就每个标准的适用性和相对权重，分类系统的易用性以及是否在本国实验室采用这种系统提供反馈。超过 33 个实验室的回应表明多数支持拟议的方法，反馈意见进一步指导了拟议标准和准则的制定。2013 年 11 月，工作组在 AMP 会议上与 50 多名与会者举行了研讨会，介绍了修订的分类标准和两个潜在的评分系统。一个系统与这里提出的方法一致，另一个系统是一个
7、点系统，其中每个标准给出了一些点，为病原标准指定积极点和良性标准的负点，从而对所以突变的分类进行了定义。通过观众回应系统，参与者被问及如何在评估突变证据时对每个标准（强，中等或支持或不使用）进行加权。同样，这些答复也纳入了这里介绍的分类系统。应该指出的是，虽然大多数答复者都赞成一个积分制，但工作组认为，为每个标准指定具体要点意味着对目前不支持科学评估的每个标准的定量水平的理解，并没有考虑到解释遗传证据的复杂性。工作组还对来自其他专业社会和工作组的建议进行了评估，其中已经制定了乳腺癌，结肠癌和囊性纤维化中良好基因的变异分类指南，以及用于定量评估选择性疾病变异的统计分析程序 .2-5。虽然这些突变
8、分析指南在特定环境中是有用的，但是很难将其提出的标准应用于所有基因和不同的实验室设置。本文中描述的突变分类方法适用于所有孟德尔基因的突变，无论是通过单基因检测，多基因定位，外显子测序还是基因组测序鉴定。我们期望随着技术和知识的改进，这种突变分类方法将会发展。我们还应该注意，在特定疾病组中工作的那些人应该继续制定关于特定基因中突变分类的更集中的指导，因为赋予某些标准的适用性和重量可能因基因和疾病而异。一般考虑术语突变被定义为核苷酸序列的永久变化，而多态性定义为频率高于 1的突变。 然而，广泛使用的术语“突变” 和“多态性”通常分别导致由于不良假定的致病性和良性效应而引起的混淆。 因此，建议将两个
9、术语用术语“突变”替换为以下修饰物：（i）致病性， （ii）可能的致病性， （iii）不确定的意义， （iv）可能良性或（v）良性。 虽然这些修饰剂可能不涉及所有人类表型，但是它们包括与本指南中所述的与孟德尔病有关的突变的五级分类系统。 建议所有的致病的诊断（包括“可能致病”的报道）是相对于条件和遗传模式（例如，c.1521_1523delctt（p.phe508del） ，致病性，囊性纤维化，常染色体隐性遗传） 。应该指出的是，一些实验室可能会选择拥有额外的分类层级（例如，对具有不确定意义的突变进行分类，特别是内部使用） ，这种做法不被认为与这些建议不一致。还应该指出，这里推荐的术语与目前用
10、于分类细胞遗传学微阵列检测的拷贝数变异的建议有所不同 .6。推荐用于拷贝数突变的模式，同时包括五个层次，使用“ 不确定的临床意义 - 可能致病性“ 和” 不确定的临床意义 - 可能良性“。大多数工作组不支持使用“ 不确定的意义 “术语修改为 ”可能致病”或“可能是良性”，因为认为这里提出的标准将突变分类为“ 可能 ”类别包括比拷贝数突变指南中概述的更强的证据，并且组合这两个类别将为接受临床报告的卫生保健提供者和个体造成混乱。然而，有人认为，使用术语“可能”应该限于数据支持很可能是致病性或很有可能是良性的突变。虽然术语“可能”没有定量定义，但在某些突变分类设置中已经提出了指导。然而，在 ACMG
11、 公开论坛期间对协会的调查显示， “可能” 一词的用途范围更广泛。认认识到这一点，我们建议将“可能致病性”和“可能良性”这一术语用于表示大于一个突变的 90的确定性是致病的或良性的，为实验室提供一个具有共同的，虽然是规定的定义，是疾病或良性的。同样，国际癌症研究机构准则 2 支持 95的致病性确定性，但工作组（通过 ACMG 公开论坛的反馈确认）认为，临床医生和患者愿意容忍稍高一些的错误机率到 90的决定。还应该指出，目前，大多数疾病具有异质性，大多数突变没有数据来支持对五个类别中的任何一个的突变确定性的定量分配。希望随着时间的推移，将会开发客观地将变异的致病性信心的实验和统计学方法开发出来，
12、并且采用更加严格的方法来定义临床协会在信心方面的期望，将更充分地说明术语和可能性。使用新术语可能需要协会的教育。鼓励专业协会对所有实验室和保健提供者进行教育，使用这些术语，并鼓励实验室直接教育其对应医师。命名方法推荐通过一组标准化标准通知的统一命名法，以确保明确指定突变，并能够有效共享和下游使用基因组信息。 标准基因变异命名法（http:/www.hgvs.org/mutnomen）由人类基因组变异学会（HGVS） 7 维护和版本化，其使用被推荐作为确定变异命名法的主要准则，除非另有说明。 6 实验室应注意检测中使用的版本。 工具软件可用于提供正确的 HGVS 术语，用于描述突变（ https
13、:/mutalyzer.nl） .8。临床报告应包括序列参考，以确保在 DNA 水平上对突变进行明确的命名，以及提供编码蛋白质命名法以协助功能性解释（例如， “g.”，用于基因组序列， “c.”，用于编码 DNA 序列， “p.”用于蛋白质，“m.”用于线粒体） 。应使用 ATG 翻译起始密码子的“A” 作为位置号 1 来描述编码术语。如果使用历史替代命名法，则应使用当前命名法以及历史命名的附加符号。 参考序列应该是完整的，并且来自国家生物技术信息中心 RefSeq 数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) 9，其版本号或 Locus 参考基因组数据库（h
14、ttp： / www.lrg-sequence.org） .10。基因组坐标或一个涵盖整个基因的基因组参考序列(包括 5和 3未翻译的区域和启动子) 应该根据标准的基因组构建来使用和定义( 例如 :hg19) 。在描述编码突变时，应在报告中使用并提供每个基因的参考文献。转录应代表最长的已知记录和/或最临床相关的记录。学会支持的参考文献通常可以通过 Locus Reference Genomic10， Consensus CDS 数据库，11 人基因突变数据库（http：/www.hgmd。cf.ac.uk） ，ClinVar（http：/www.ncbi。 nlm.nih.gov/clinva
15、r）或轨迹特异性数据库查询。 然而，实验室应该评估突变对所有临床相关转录物的影响，包括在这些区域中已知的突变在临床上可解释时含有额外的外显子或扩展的非翻译区的替代转录物。并非所有类型的突变（例如，复杂突变）都被 HGVS 建议所涵盖，但可能可以被已经报告了复杂突变所描述 .7,12。此外，该 ACMG 建议支持 HGVS 命名规则的三个具体例外：（i） 除了目前的 HGVS“*”和“Ter”建议之外， “X”仍然被认为可以用于报告无义突变。 （ii）建议根据用于指定突变的选定参考文献编号外显子; 和（ iii）推荐使用术语“致病性” 而不是 “影响功能”，因为临床解释通常直接评估致病性。文献资
16、料库的使用大量数据库包含在人类基因组中不断发现的越来越多的突变。 在分类和报告突变时，临床实验室可能会在数据库以及已发表的文献中找到有价值的信息。如上所述，序列数据库也可用于鉴定适当的参考序列。 数据库可用于收集信息，但应谨慎使用。人类数据库（表 1）可用于获取大群体变异频率。 人类数据库不能被认为仅包括健康个体和已知含有致病性突变。 这些数据库不包含关于这些突变的功能效应拓展性信息或任何可能的相关表型。 当使用人类数据库时，必须确定是使用健康队列还是疾病队列，如果可能，还应确定最好包括家庭中的一个以上个体以及符合受试者的年龄范围。疾病数据库（表 1）主要包含在患有疾病的患者中发现的突变并评估
17、突变的致病性。 疾病和基因特异性数据库通常包含错误分类的突变，包括在同行评议的文献中发布的不正确的索赔，因为许多数据库不执行证据的初步审查。 当使用疾病数据库时，重要的是考虑如何确定患者，如下所述。当使用数据库时，临床实验室应该（i）确定数据库更新的频率，数据策划是否得到支持，以及使用什么方法进行策划; （ii ）确认使用 HGVS 命名并确定用于命名突变的基因组构建和转录物参考; （iii ）确定数据的分析准确度（例如，低通次下一代测序与 Sanger 验证的突变）的程度，并评估提供用于评估数据准确度的任何质量度量，这可能需要阅读相关出版物; 和（iv）确定所列观察的来源和独立性。变异评估还
18、包括搜索科学文献和医学文献。 使用较旧的术语和分类或基于单次观察的文献应谨慎使用。 当识别具有突变的个体和家庭以及相关表型时，重要的是考虑如何确定患者。 评估发表的数据时，这一点很重要，因为受影响的个人和相关个人经常被报告多次，这取决于研究的背景和大小。 这可能是由于作者重叠，实验室间合作，或者是不同临床系统之间的先证者和家庭成员。 这可能会错误地导致受影响患者的重复计数和变异频率的虚假增加。重叠的作者或机构是重叠数据集的潜力的第一线索。临床实验室应实施内部系统，以跟踪每个基因中鉴定的所有序列变异和报告时的临床诊断。 这对于跟踪基因型 - 表型相关性和受影响和正常人群中变异体的频率非常重要。
19、鼓励临床实验室对诸如 ClinVar 等突变数据库做出贡献，包括用于变异分类的临床断言和证据，以帮助持续了解人类变异的影响。 只要有可能，应根据“ 健康保险可移植性和责任法案 ”隐私规定提供临床信息。鼓励临床实验室与临床医生形成合作，提供临床信息，以更好地了解基因型如何影响临床表型，并解决实验室之间变异解释的差异。 由于辅助临床实验室实践的巨大潜力，正在努力扩大和标准化临床突变数据库。 标准化将更容易获得更新的信息，并便于临床实验室提交。 例如，ClinVar 数据库允许通过临床观察和诊断来确定突变位点，并且跟踪检查状态，以使对策略质量水平的透明度更高。计算（计算机）预测程序公开和商业上可用的
20、各种计算机工具可以帮助解释序列突变。 每个工具使用的算法可能不同，但可以包括确定序列突变在核苷酸和氨基酸水平的影响，包括检测突变对初级和替代基因转录物，其他基因组元件的影响，以及 、该突变对蛋白质的潜在影响。 这些工具主要的两个类别包括那些预测错误变化是否损害所得蛋白质功能或结构的工具，以及预测是否对剪接有影响的工具（表 2） 。更新的工具开始解决额外的非编码序列。 13错误变化的影响取决于诸如氨基酸或核苷酸进化的保守性，蛋白质序列内的位置和上下游以及氨基酸取代的生物化学结果等标准。这些标准中的一个或组合的测量用于评估错误改变的预测影响的各种计算机算法。有几项努力评估了可用的预测软件的性能，以
21、便将它们相互比较，并评估其预测“已知”致病突变的能力 .14-17。一般来说，大多数误差变异预测算法的准确度为 65-80检查已知的疾病突变。 16 大多数工具往往具有较低的特异性，导致错误更改过早预测有害，并且在预测具有较高效果的错误突变方面不可靠.18 临床实验室中更常用于错误突变解释的计算机工具包括 PolyPhen2， 19 SIFT， 20 和MutationTaster.21 表 2 中可以找到用于预测错误突变的计算机工具列表。已经开发了多个软件程序来预测剪接，因为它与在外显子或内含子水平上的剪接位点的产生或丧失有关.22 一般来说，剪接位点预测工具相对于特异性（90-100）具有
22、更高的灵敏度 60-80）预测剪接位点异常.23,24 通常用于剪接位点突变解释的一些计算机工具列在表 2 中。虽然许多不同的软件程序使用不同的算法进行预测，但它们的基础有相似之处; 因此，从不同的计算机工具组合的预测被认为是序列解释中的单一证据，而不是独立的证据。 还推荐使用多个软件程序进行序列突变解释，因为不同的程序每个都有自己的优点和缺点，这取决于算法; 在许多情况下，性能可以由基因和蛋白质序列变化决定。 然而，这些只是预测，并且应该仔细地实施它们在序列突变解释中的使用。 不建议将这些预测用作作为临床断言的唯一证据来源。对序列变异的解释标准用于评估突变证据的方法旨在解释在临床诊断实验室环
23、境中疑似遗传（主要是孟德尔）病症的患者中观察到的突变。 它不是用于解释体细胞变异，药物基因组（PGx ）突变或与多基因非孟德尔复合障碍相关基因的突变。 在外来组织或基因组研究的背景下，将这些规则应用于候选基因（“不确定的基因”（GUS） ）时，必须注意，因为本指南并不旨在满足研究界在确定疾病中的新基因的需要。虽然这些方法可用于评估健康个体中发现的突变或继发性检测指征，但如指南中的几个部分所述，必须进一步注意，因为与指示无关的大多数突变是致病性的。虽然我们期望，一般来说，这些指南将适用于突变分类，无论通过单个基因，基因组，外显子，基因组或转录组的分析来确定突变，重要的是考虑牵连变异体之间的差异作
24、为可能被预测为其编码但不一定涉及疾病的蛋白质具有破坏性/破坏性的疾病和突变的致病性（即致病性） 。这些规则旨在确定在孟德尔病症中具有确定作用的基因中的突变是否可能是该病症的致病性。致病性检测应独立于在给定患者中解释疾病的原因。例如，一个突变不应该在一种情况下报告为致病性，而不是在另一种情况下报告为致病性，仅因为该突变在某种情况下不被认为解释疾病。致病性应由整个证据的整体确定，包括所有研究的病例，得出一个结论。这种分类方法可能比实验室迄今应用的要严格得多。 它们可能导致较大比例的突变被归类为不确定的意义。 希望这种方法将减少大量的变异报告为疾病的“病因”，因为没有足够的支持证据证明该分类。 重要
25、的是要记住，当临床实验室将突变报告为致病性时，医生很可能将其视为“可行动的” ，并改变对患者的治疗或监视 25 或者去除对该基因阴性的家庭成员的管理，基于这一决定（见下面的卫生保健提供者如何使用这些指南和建议） 。我们提供了两套标准：一种用于分类致病性或可能的致病性突变（表 3） ，一种用于良性或可能良性突变的分类（表 4） 。每个致病标准被称为非常强（PVS1） ，强（PS1-4）;中度（PM1-6）或支持（ PP1-5） ，并且每个良性标准被加权为独立（BA1） ，强（BS1-4）或支持（BP1-6 ） 。每个类别中的编号不表示任何重量差异，只是标记为帮助参考不同的标准。对于给定的突变，用
26、户根据对突变观察到的证据来选择标准。然后根据表 5 中的评分规则组合标准，从五层系统中选择分类。这些规则适用于所有可用的突变数据，无论是从当前被调查案件收集，还是从以前公布的数据中获悉。还可以通过公共资源（例如，ClinVar 或基因座特定数据库）和实验室自己的数据库获得未发布的病例数据。为了提供突变分类的标准的灵活性，根据所收集的证据，可以使用专业判断将一种重量的标准移动到另一种重量。例如，如果一个反式突变（在反式染色体上）的检测值是在其他致病性突变检测突变的数倍（参见 PM3 BP2 顺式/ 反式检验进一步指导） ，则 PM3 可以升级为强。相比之下，在数据不如所述的那么强的情况下，可以使
27、用判断来将证据视为履行较低级别（例如参见 PS4，表 3中的注 2） 。如果一个突变不符合使用这些组（致病性或良性）的标准，或者良性和致病性的证据是相互冲突的，那么突变默认为不确定的意义。按类型和实力组织的标准如图 1 所示。请注意，在评估全部证据以解释突变证据强度的差异时，必须采用专家判断。提供以下内容以更彻底地解释突变分类标准中注明的某些概念（表 3 和 4） ，并提供其使用中的示例和/或注意事项或陷阱。本节应与表 3 和表 4 相一致。PVS1 无义突变通常可以假设某些类型的突变（例如，废话，移位，正常的1 或 2 个剪接位点，起始密码子，单个外显子或多重缺失突变）通过缺少转录而导致完全
28、不存在基因产物来破坏基因功能或无义介导的衰变导致转录物的改变。 但是，通过考虑以下原则，将这些突变分类为致病性时，请谨慎行事：（i） 当将这些突变分类为致病性时，必须确保无效突变是已知的致病性机制，与确定的疾病遗传模式一致。 例如，存在仅杂合错义突变导致疾病的基因，而无义突变在杂合状态中是良性的（例如，许多增生性心肌病基因） 。 仅基于该证据，MYH7 基因中的新型杂合无义突变将不被认为是主要肥厚性心肌病的致病性，而CFTR 基因中的新型杂合无义突变可能被认为是隐性致病突变。（ii） 患者具有与中祖辈相一致的疾病（例如，未受影响显性遗传病的父母） 。 然而，由于种系嵌合，有可能影响其他兄弟姐妹
29、。（iii ） 患者的表型与合理的特异性匹配基因的疾病关联。 例如，对于具有独特面部特征，多毛症和上肢缺陷（即 Cornelia de Lange 综合征）的 NIPBL 基因中具有隔代遗传的患者，这一观点是强的，而在具有非特异性特征如发育迟缓的儿童中通过外显子测序发现的突变，隔代遗传则较弱。PS3 BS3 功能研究功能研究可以成为支持致病性的有力工具; 然而，并非所有功能研究都可以有效预测基因或蛋白质功能的影响。 例如，某些酶检测提供了确定的方法来评估错义突变对代谢途径（例如 -半乳糖苷酶功能）中酶功能的影响。 另一方面，一些功能测定可能不太一致地预测突变对蛋白质功能的影响。 为了评估功能测
30、定的有效性，人们必须考虑功能测定反映生物环境的程度。 例如，从患者或动物模型的活检组织直接测定酶功能提供比在体外表达蛋白质更强的证据。同样地，如果测定反映了蛋白质的完整生物学功能（例如，酶的底物分解）与仅具有一个功能组分（例如具有附加结合特性的蛋白质的三磷酸腺苷水解）相比，证据力度更强。评估测定的分析性能和考虑样品完整性的验证，重现性和稳健性数据可能受到采集方法和时间以及储存和运输的影响，是重要的考虑因素。在临床实验室改进修订实验室开发的测试或市售试剂盒中的测定中，这些因素得到缓解。评估突变在信使 RNA 水平的影响的测定在评估突变在剪接点和编码序列和非翻译区以及更深的内含子区域（例如，信使 RNA 稳定性，
