1、PCR 扩增及 DNA 琼脂糖凝胶电泳刘琳 1131428 环境科学一、实验目的1学习并掌握 PCR 扩增的基本原理与实验技术。2对扩增后的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理1. PCR 扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP） 、耐热 Taq 聚合酶及两个合成 DNA 的引物，而后加热使模板 DNA 在高温下（94）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55）与模板 DNA 互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中
2、温（72） ，在 Tap 酶作用下，用四种 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和 DNA 合成这一循环，使产物 DNA 重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物 DNA 可作为后一循环的模板 DNA 而参与 DNA 的合成，使产物 DNA 的量按指数方式扩增。经过 3040 个循环，DNA 扩增即可完成。2. DNA 琼脂糖凝胶电泳实验DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构
3、型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器：PCR 扩增仪、0.2ul 薄壁管、1.5ml 离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂： TapDNA 聚合酶、dNTP 、buffer 、两种引物、16S 全长 DNA 样本、无菌ddH2O、模板 DNA 、TBE 、琼脂糖、EB、显色剂。四、 实验步骤1. PCR 扩增本次试验选择细菌 16S rDNA V3 区片段进行扩增。1.1
4、 根据计算，首先取 1.5ml 离心管按照 2.5ul 10Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O 的比例配置足量的 PCR 反应体系。1.2 分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加 8 种不同的模版，并于第 9 个薄壁管中加入无菌 ddH2O 作为阴性对照。1.3 将薄壁管放入 PCR 扩增仪中，按照预定程序进行 PCR 扩增。其中循环过程需要达到3040 次。程序如下：预变性： 94 3min循环： 94 变性 30s55 退火 30s72 延伸 30s末次延伸：7
5、2 5min1.4 PCR 扩增完成后，将样品取出并保存于 15环境中。2. DNA 琼脂糖凝胶电泳实验2.1 称取 0.2g 琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的 0.5TBE 电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至 60左右，在胶液内加入适量的 EB。2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。2.4 在槽内加入 0.5TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取 1l缓冲液和 5l待测 DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。2.
6、5 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过 5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。2.6 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约 1cm 处，可停止电泳。2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。五、实验结果与讨论如图所示：从左至右，分别是模版 1-8 号，第 9 列为阴性对照。前 8 列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段
7、在 200bp 左右。在第 9 个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的 marker 对比可知该片段出现在 100bp 左右，并非由于实验操作等问题而产生的污染。实验的照片显示实验结果有拖尾现象，但是并不影响后续实验。在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，并没有完全加入，可能会出现一些误差。另外在第 1 列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实
8、验结果较为满意。六、实验注意事项1.由于 PCR 技术非常敏感，可使一个 DNA 分子得以扩增，装有 PCR 试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR 扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。2.最好在加完所有其它反应成分后才加模板 DNA。3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。4.EB 具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。七、实验收获1.通过本次实验学习并掌握了 PCR 反应的基本原理、实验过程及技术。2.通过本次实验掌握了电泳实验分离 DNA 的原理和方法。八、思考题1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何
9、进行相关实验？通过 PCR 扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒，进行酶切或 PCR 验证，测序最终验证，保存菌种2.一对引物序列为 5-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3和 5-AACCGTGGCGACACCGCTAA 请计算它们的 Tm 值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做 PCR 时没有得到相应的产物，你怎么解决？5-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3Tm 值=4（G+C）+2(A+T)-(5 10)=4（3+7）+2（6+4）-(510)=60-(510)=50555-AACCGTGGCGA
10、CACCGCTAATm 值=4（G+C）+2(A+T) -(510)=4(5+7)+2(6+2) -(510)=64-(510)=5459因此退火温度可以选择在 55可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5，以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5 或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
