1、实训项目十七 高效液相色谱法测定食品中的维生素 C一、实验目的（1）掌握高效液相色谱法测定维生素 C 的方法。（2）熟悉蔬菜或水果中维生素 C 的提取方法。二、实验原理维生素 C（分子式：G 6H806） ，极易溶于水，水溶液显酸性，具有较强的还原性，不稳定。见光易氧化，氧化产物为脱氢型维生素 C，并进一步水解成2，3二酮古洛糖酸。样品经偏磷酸 乙酸提取，经高效液相色谱分离，测定波长 266 nm，在相同的实验条件下，将不同浓度的维生素 C 标准溶液也注入色谱系统，分别测定样品和标准溶液中维生素 C 色谱峰的保留时间和峰面积，进行定性和定量分析。三、主要仪器和试剂1仪器 高效液相色谱仪（附紫外
2、检测器） ；C 18 色谱往（4. 6 mmx250 mm，5m） ；超声波清洗器；25m 微量进样器；微孔过滤器及 0.45 m 微孔滤膜滤膜（水系和有机系） ；10200L 精密移液器；定量滤纸。2试剂 偏磷酸一乙酸液；0.15 mol/L 硫酸；偏磷酸一乙酸一硫酸液；0.04百里酚蓝指示剂；0.02 mol/LpH5.6 磷酸二氢钾缓冲盐溶液；甲醇（色谱纯） 。四、操作步骤1. 色谱条件流动相：甲醇：0.01 mol/L pH5.6 磷酸缓冲溶液（40：60） （此比例可根据所使用的色谱柱性能进行适当调节） ，使用前过滤和超声波脱器；流速1.0mL/min；检测波长：266nm。2.试剂
3、配制偏磷酸醋酸溶液：称取 15g 偏磷酸，加入 40 mL 冰醋酸及 250 mL 水，加热搅拌，冷却后用水定容至 500 mL。0. 15 mol/L 硫酸：取 10 mL 硫酸，小心加入水中并不断搅拌，再加水稀释至 1200 mL。 偏磷酸醋酸硫酸液：以 0.15 mol/L 硫酸为溶剂，其余同配制。0.04百里酚蓝指示剂溶液：称取 0.1 g 百里酚蓝，加 0.02 mol/L 氢氧化钠溶液约 10 mL，在研钵中研磨至溶解，用水稀释至 250 mL。维生素 C 标准溶液的配制：准确称取维生素 C10 mg，加少量偏磷酸乙酸硫酸液溶解，用棕色容量瓶定容至 100 mL，即得 0.1 mg
4、/mL 的维生素 C标准储备液，4 贮存。分别吸取维生素 C 标准储备液 0.25、0.50、1.00、1. 50、2.00、2.50 mL 于 25 mL 棕色容量瓶中，加偏磷酸乙酸溶液稀释至刻度，即得含维生素 C 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/mL 的标准系列溶液。3. 样品液的制备蔬菜或水果：取约 100g 新鲜样品，精密称定，倒入捣碎机内打成匀浆，然后准确称取匀浆 2050 g，加 50 mL 偏磷酸乙酸溶液稀释，充分混合匀浆。用百里酚蓝指示剂指示匀浆酸碱度，如显红色，直接用偏磷酸乙酸溶液稀释；如呈黄色或蓝色，则用偏磷酸乙酸硫酸液稀释使其 pH 为 1.2（显红色
5、） ，然后用偏磷酸乙酸溶液定容至 100 mL（棕色容量瓶） ，定量滤纸过滤。以上操作均应透光。4. 色谱分析根据样品中维生素 C 含量不同，将试样处理液用偏磷酸乙酸溶液进行稀释，然后取其稀释液和标准系列溶液各 20L，分别注入高效液相色谱进行分离分析。五、数据记录与处理以标准溶液维生素 C 色谱峰的保留时间为依据进行定性，然后分别测量峰面积，作峰面积维生素 C 浓度的标准曲线或回归方程，根据试样维生素 C 面积从标准曲线或回归方程得出试样处理液中维生素 C 的浓度，并计算样品中的含量。维生素 C 含量（mg/100g）=1001000式中，c由标准曲线或回归方程求得试样稀释液中维生素 C 的浓度，g/mL；V试样定容体积，mL；m试样质量，g；F试样溶液的稀释倍数。六、注意事项维生素在空气中易氧化，故应在进样前配制。若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。七、问题与讨论1. 本实验样品处理和贮藏过程中为什么要低温、避光？2. 维生素 C 含量测定还有哪些方法？
