1、第九章 蛋白质和多肽类药物的分析,第一节 概述,一、蛋白质和多肽重要理化性质二、蛋白质和多肽类药物质量控制标准三、蛋白质和多肽类药物的活性及测定方法,一、主要理化性质,高分子特性：是其胶体性、变性和免疫学特性基础两性解离与等电点：影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析颜色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应紫外吸收：280nm处最大吸收，可定量蛋白质和多肽,（一）高分子特性,是其胶体性、变性和免疫学特性的基础,1、胶体性质,可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体（1-1
2、00nm）。,疏水色谱,2、变性与复性,蛋白质高级结构是其理化特性及生物学功能基础。当蛋白质受某些理化因素影响，其分子内原有高级构象发生变化，蛋白质理化性质和生物学功能改变或丧失，但一级结构未变，即变性作用(denaturation) 表征：生物活性丧失；物理（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性）和化学（化学反应，被酶解性）改变.,生物活性,3、凝集（Aggregation）,（二）两性解离与等电点,影响多肽、蛋白质分离、纯化和分析,（三）颜色反应,可用于蛋白质定量与定性分析 1）茚三酮反应 2）双缩脲反应 3）酚试剂反应,双缩脲反应,红紫色络合物,(碱性溶液),Cu2+,（四）紫外吸收,蛋白质
3、和多肽组成中常含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰,二、蛋白质和多肽类药物质量标准,（一）原液质量标准（二）成品质量标准,（一）原液质量标准,生物学活性、比活性（见药典附录C）蛋白质含量（见Chp附录D）纯度：95%，非还原SDS-PAGE（见Chp附录C）、HPLC法（见Chp附录B）分子量：还原型SDS-PAGE法（见Chp附录C）、质谱法外源性DNA残留量：10ng/剂量（见Chp附录B）,宿主蛋白残留量：0.1%，0.05%（见Chp附录C）残余抗生素：不得检出（见Chp附录A）细菌内毒素：10EU剂量（
4、见Chp附录E凝胶限量试验）结构确证：等电点（见Chp附录D）、紫外吸收光谱扫描（见Chp附录A）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见Chp附录E）、氨基酸组成,（二）成品质量标准,鉴别试验：免疫印迹或斑点法，阳性物理检查：外观、可见异物、装量化学检查：水分、pH值生物学活性：标示值的%范围无菌检查：不得检出内毒素检查：10EU剂量异常毒性检查：符合规定,三、蛋白质和多肽类药物活性及测定方法,（一）生物学活性及比活性测定（二）生物学活性测定方法分类（三）生物学活性测定方法选择（四）生物学活性测定（五）蛋白质药物的比活性,（一）生物学活性及比活性测定,检测意义获取准确的效价信息，保证产品有效效价：
5、有效性指标，反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致生物制品技术药:单位（U、AU、IU）,（二）生物学活性测定方法分类,1、动物基础的活性测定 1）离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 2）体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞2、细胞基础的活性测定 1）促细胞生长法：大多数细胞因子类 2）抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 3）间接保护细胞法：IFN保护WISH3、酶学基础的活性测定：重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗原决定簇与活性中心常不一致,（三）生物学活性测定方法选择,1、细胞培养法离体器官法体内法
6、2、细胞染色标记方法：MTT3H-Thymidine流式细胞仪（测细胞周期）3、定量法半定量法定性法4、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。如rh-GH用HPLC,（四）生物学活性测定（Chp附录C）,样品：原液、成品标准：不同生物活性测定方法的规定标准 测定方法 规定标准 动物基础的活性测定 70%130%标示量 细胞基础的活性测定 80%120%标示量 酶学基础的活性测定 85%115%标示量 结合反应的活性测定 85%115%标示量,（五）蛋白质药物的比活性,样品：原液定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性单位（IU/mg）意义：真实反映有活性的蛋白
7、质所占的比例，厂家间、表达系统间、批间比较便于配制成品,第二节 蛋白质和多肽类药物分析,一、鉴别二、结构确证三、检查四、含量测定五、残余杂质检测六、安全性及其他检查,一、鉴别,鉴别药物的真伪（一）化学鉴别：双缩脲反应（是否蛋白质/多肽类）,（二）紫外吸收光谱扫描（Chp附录A）,样品：原液方法：紫外扫描标准：最大吸收波长与特征波长一致、批与批间一致一级结构不含芳香族氨基酸重组药物，在280nm附近没有最大吸收峰，可不做紫外吸收光谱测定,重组脑利钠肽(rhBNP),（三）免疫印迹,方法：通常用免疫印迹（immunoblotting）和斑点免疫（Dot Immunobinding）进行鉴定，特别当
8、电泳出现两条或两条以上区带时则应该用免疫印迹进行鉴定标准：阳性,（四）HPLC法,根据待测样品（T）与标准品（S）/对照品方法的保留时间（t0）的一致性进行定性分析当T的t0与S完全相同，则能判定T可能与S为同一物质；特别是如果色谱条件改变，T的t0与S的t0仍能一致，则基本判定是同一物质,二、结构确证,等电点（PI）测定紫外光谱扫描末端氨基酸序列测定肽图分析氨基酸组成分析,（一）等电点测定（Chp附录D）,不同蛋白质或多肽具有不同等电点，可以表征药物纯度等电点测定是控制重组产品生产工艺稳定性的重要指标：均一的重组蛋白质只有一个等电点，有时因加工修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范围,方
9、法： 1）等电聚焦电泳法（IEF）： 2）毛细管电泳法（CE）：该法用紫外检测，适用于某些不易染色的Pr/多肽，如EGF、hCGRP等制品的测定标准:标准：有明显主带、理论值0.5pH范围、批与批间一致,（二）末端序列分析（Chp附录E）,作为重组蛋白质和多肽的重要鉴别指标，一般要求： 1、N末端：15个残基（Edman化学降解法、Pr全自动测序仪） 2、C末端：1-3个残基（羧肽酶降解法、RP-HPLC），但在我国现有法规中C端不一定要测定封闭N-末端测定（N-末端乙酰化、焦谷式N-末端）标准：与理论值一致、批与批间一致,de novo Protein Sequencing,1、N-端测序,
10、方法：Edman化学降解法-异硫氰酸苯酯（PITC)法样品处理： 1）纯度鉴定：97% 2）脱盐 3）巯基保护：碘代乙酰胺 4）去除N-端封闭的基团：酸水解、酶处理,2、C-末端测序,方法：羧肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链的C端逐个水解氨基酸。根据不同反应时间测出酶水解所释放氨基酸种类和数量，从而知道Pr的C末端残基顺序由于羧肽酶对不同的C末端氨基酸作用的速度不同，且反应是连续的，不能停在某一步上，给正确判断氨基酸顺序造成了一定困难,4种常用羧肽酶,19种标准氨基酸色谱图,N-端序列分析，二硫键定位分析，检查位点修饰情况（如糖基化或磷酸化）,（三）肽图分析（Chp附录E）,概念：根
11、据蛋白质、多肽的氨基酸排列顺序，使用各种定位裂解方法将蛋白质、多肽裂解成大小固定的多个小分子肽链，通过分离并检测，形成可供鉴别的特征性指纹图谱意义:一级结构，工艺稳定性方法：溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE /CE/质谱法标准：有特征性图谱/批与批间一致,化学裂解法：非特异性降解，裂解位点少蛋白酶裂解法：特异性降解，裂解位点较多特殊处理: 二硫键、空间构象较复杂特殊产品,肽图裂解方法,肽图分析方法,RP-HPLCCEHPLC-MSSDS-PAGE,Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in pho
12、sphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase,Comparability Analysis by Peptide Mapping LC-MS/MS for a biosimilar mAb to its origi
13、nal mAb identified an amino acid mutation and several PTMs (oxidation and deamidation), shown by the red arrows, as compared to the biosimilar mAb.,Sequence coverage and Peptide-mass fingerprinting of CRM197 digested with acid hydrolysis and LysCby, respectively.,利妥昔单抗肽图分析,Tryptic peptide map analys
14、is of stability monoclonal antibodies by hydrophobic interaction chromatography. Selected region of tryptic peptide maps of a stability sample held at 40C for 0 weeks (black), 12 weeks (blue), or 24 weeks (red).,HPLC pattern of S. aureus fingerprint of human(a) and bovine (b) insulin,（四）氨基酸组成分析,结构分析
15、的辅助手段，质量控制的重要指标。对水解后产生的氨基酸种类定量测定，获得各种氨基酸摩尔比，对蛋白质/多肽进行鉴别在试生产的头三批或工艺改变时应当测定方法：HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定）+氨基酸自动分析仪标准：与理论值一致，批与批间一致,3个步骤，即：,氨基酸组成分析步骤,Representative chromatograms for hydrolysate amino acids and free amino acids,1、蛋白质及肽水解方法,虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，但还没有一种单独适用于所有残基的，并且能在水解液中定量回收的水解
16、方法出现，很多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全程度均有影响,（1）酸性水解,HCl是最通用的水解剂（6mol/L HCl、真空、110，2024h）优点：氨基酸不消旋缺点：Trp被完全破坏；Ser、Met有部分被破坏，损失分别为10%和5%；Thr部分被水解液中痕量杂质所破坏；Cys水解后会转换成Cys-Cys，Asn和Gln被水解成Asp 和 Glu,（2）碱性水解,水解剂NaOH和KOH（5mol/L NaOH，充氮气，110，22h）优点：HCl水解的互补法，限于测定Trp的含量缺点：多数氨基酸或遭到破坏，或外消旋化,（3）酶水解,用一组蛋白酶水解肽链，特别适用
17、于对化学水解敏感的氨基酸如Asn和Gln的测定优点：水解过程中氨基酸不发生消旋化，氨基酸不被破坏缺点：反应需时长，水解不完全。另外，因为酶白质可能干扰样品的测定,2、特殊氨基酸的保护,不同水解条件下，各种氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半胱氨酸可能遭水解破坏，导致无法正确测定其含量。因此水解过程中，需要考虑对特殊氨基酸的保护,（1）Trp的保护,酸水解液中加入巯基乙酸和-巯基乙醇，可使Trp的回收可达80；3mol/L疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸对色氨酸进行保护利用蛋白酶作为水解剂，对Asn和Gln及Trp均无破坏作用用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护Trp不被破坏,（2）
18、Cys的保护,柱前衍生化： 色谱柱：RP HPLC 衍生化方法：异硫氰酸苯酯（PITC）法、邻苯二醛（OPA）法、9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法柱后衍生化： 色谱柱:阳离子交换色谱柱 衍生化方法：茚三酮反应,3、氨基酸的衍生化,（1）PITC柱前衍生分析法,原理：氨基酸与PITC反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经RP HPLC分离后用紫外检测，其吸光值与氨基酸浓度成正比线性浓度范围：0.0251.25mol/ml,（2）AQC柱前衍生分析法,原理
19、：氨基酸与AQC反应，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸经RP HPLC分离后用紫外或荧光检测，其吸光值与氨基酸浓度成正比线性浓度范围：2.5200nmol/ml,（3）OPA和FMOC柱前衍生法,原理：在巯基试剂存在下，首先与OPA反应，生成OPA-氨基酸；然后加入FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，经RT HPLC分离后用紫外或荧光检测，其吸光值与氨基酸浓度成正比线性浓度范围：0.0252.5mol/ml,The figure shows typical traces for a mixture of standard amino acids (l
20、eft) and a peptide hydrolysate (right), so that it is possible to identify which amino acids are present in the peptide.,（4）DNFB柱前衍生分析法,原理：氨基酸与DNFB反应，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸经RT HPLC分离后采用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比线性响应范围：30140 pmol,（5）茚三酮柱后衍生分析法,原理：氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后，与茚三酮反应，除Pro和Hpro产生黄色物质，其它氨基酸
21、都产生蓝紫色物质，分别在440nm和570nm下检测上述反应产物，其吸光值与氨基酸浓度成正比线性响应范围：20500 pmol,（五）相对分子质量测定,1、还原型SDS-PAGE法（Chp附录C）适用范围：Mr为15200kD标准：理论值10范围，批与批间一致,2、质谱法特点：具有准确、快速，重复性好，测定范围广等特点适用范围：Mr10kD的Pr和多肽,Multiply charged ion peaks of myoglobin analyzed by ESI-ion trap mass spectrometer,（六）二级结构测定,通常采用圆二色光谱(CD）测定溶液状态下的蛋白质二级结构含
22、量。,mdeg,Wavelength (nm),200,220,The far-UV CD spectra were obtained before and after 276 nm light continuous exc. (0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2.5 h, 3.5 h, and 7 h) of insulin in solution. There is a progressive loss of ellipticity signal with 276 nm exc. time at 195, 209 and 222 nm.,Circular dichroism spec
23、trometry in the ultraviolet wavelength region (UV-CD) of MBP-cytochrome b fusion protein in different detergent solutions.,（七）二硫键定位,Theoretical S. aureus protease fragmentation of human insulin (，residues of glutamine),二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关。对二硫键的分析虽然在常检定项目中没有规定，但在质量研究中应尽可能分析清楚有些产品二硫键较多，用现有的技术完全分析清楚很困难
24、，可以结合其他项目的检测，如比活性等进行有效的质量控制,方法：碘代乙酰胺保护游离巯基，胃蛋白酶水解样品（切点多，酸性环境下防止二硫键交换），将所得肽段用对角线电泳分离,对角线电泳,蛋白质寡糖可以上调、下调或抑制糖蛋白的生物活性，影响蛋白质代谢命运、稳定性或溶解性通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白；即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同和普通寡糖产生的相对频率不同而产生截然不同的糖蛋白,（八）糖基化分析,糖基化分析内容： 糖基化位点、分子量、糖组成、连接方式分析方法： 酶解、质谱、LC/MS、GC/MS,CE analysi
25、s of IgG glycans. Lower trace: High resolution analysis of APTS derivatized IgG glycans, Upper trace: CE separation of APTS derivatized maltooligosaccharide ladder,Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary e
26、lectrophoresis. The maps from two different expression systems are shown, the upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase.,三、检查,检查内容：纯度；相关杂质（产品相关、工艺过程相关）（一）多肽类药物（二）蛋白质类药物,（一）多肽类药物,氨基酸比值：通过氨基酸分析法测定其各种氨基酸比值有关物质：合成过程中产生的肽
27、类杂质、降解杂质、聚合物和光学杂质，采用梯度洗脱RP HPLC或毛细管电泳法醋酸：多肽类药物多为其醋酸盐，采用RP HPLC,（二）蛋白质类药物,有关物质：相关Pr杂质，采用梯度洗脱RP HPLC高分子蛋白质：高分子聚合物，采用分子排阻色谱法生物活性：生物检定,1、纯度检查,样品：原液方法：必须采用两种方法测定（非还原SDS-PAGE和HPLC）标准：纯度均达到95%或98%以上,（1）非还原SDS-PAGE法（Chp附录C）,SDS-PAGE：据分子大小分离样品处理：样品不加-ME或DTT（二硫键未打开，反映单体、二聚体和多聚体情况）染色方法与上样量：银染，5g（检测限为1-10 ng）；考
28、马斯亮蓝R-250，10g（检测限为0.1g）定量方法：凝胶扫描，以峰面积按归一化法计算标准：无明显杂带，纯度95%或98%执行中国药典三部的生物制品应采用银染A 法,胶浓度对电泳结果的影响,上样量对电泳结果的影响,染色方法对电泳结果的影响,蛋白质制剂在保存期间易形成聚合体，并随蛋白质浓度和保存温度的升高而增加，这些作用直接影响此类制品的安全性和有效性多聚体形成有很多原因：氧化、疏水、浓度和pH直接关系,（2）HPLC法（Chp附录B）,保证T中所有组份均出峰的情况下，用T峰面积/峰高除以所有峰面积/峰高总和即目标Pr纯度应根据不同的纯化工艺选择不同方法，一般尽量采用与SDS- PAGE法原理
29、不同的反相柱或其他离子交换柱进行分析，而不主张用分子筛分析在质量标准中要说明采用的是什么性质的分析柱，如有些产品不适合用反相柱，要说明原因,分析柱：反相柱、离子柱、分子筛（应尽量采用反相柱或离子柱，应注明采用分析柱的性质）上样量：5g标准：出峰时间正确，纯度95%或98%,The analysis of MAb shows that resolution of monomer and aggregate peaks is higher on the SuperSW column, as is the detection sensitivity,A minor impurity or fragm
30、ent detected in HSA by UHPLC with a 300mm size-exclusion column and UV + UT-rEX RI. The different UV:RI ratio of the fragment relative to the monomer and dimer indicate a different primary composition,TSKgel SuperSW mAb HTP showed superior resolution of mAb dimer and monomer even at high flow rates
31、with low pressure,如何认识蛋白质类药物纯度检测？,从蛋白质制剂中检测出少量污染蛋白质很困难：污染蛋白质的量可能低于很多测定方法检测下限；制剂中往往含有大量辅料当用一种方法测定蛋白质纯度时，可能有两种或更多的蛋白质表现出相似行为，只用一种方法作为纯度试验标准很不可靠,建立多种分析方法，须从等电点、相对分子质量、疏水性等不同角度来证明蛋白质样品的均一性纯度结论取决于所用方法类型和分辨力，低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方法时可能证明不纯没有一个真正检验纯度的方法，只有检测样品不纯或非均一的方法,四、含量测定（Chp附录D）,目的主要用于原液比活性计算和成品规格的控制采用Fo
32、lin-酚试剂法(Lowry法)、染色法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法和HPLC法等方法，其中Lowry法和Bradford法是在质量检定中经常使用的方法,1、Folin-酚试剂法(Lowry法),原理：在碱性溶液中蛋白质肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比用于微量蛋白质的含量测定，灵敏范围：5100g/ml,优点：方法简便，灵敏度较高；所用仪器简单，不同T间的变异少，需时约40min，优先采用缺点：Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此蛋白质中若含有酚类
33、、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用；不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同,2、Bradford法,原理：考马斯亮蓝G-250（CBB G-250，max=488nm）与蛋白质结合后形成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收峰，且蓝色深浅与蛋白质浓度成正比。国外已将重组制品将Bradford法作为样品含量常规检定方法灵敏范围：25200g/ml；0.1ml的最小体积可测得的最低蛋白质为2.5g,优点：试剂配制简单，操作简便快捷；迅速（2min）；敏感（较Lowry法高4倍）；结合物在室温下1h内保持稳定；所需蛋白质量少（微克级）；干扰物质少等优点缺点：较高浓度SDS、Triton
34、X-100等对其有干扰；不同的纯化蛋白质间有可变性,3、BCA法,原理：在碱性的条件下，蛋白质与Cu2+络合，并将其还原Cu1+；Cu1+和BCA（bicinchoninic acid，二辛可酸）试剂反应，使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，该水溶性复合物在562nm处有强烈的光吸收，吸光度和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系 定量范围：20g/ml-200g/ml，微量BCA测定范围：0.5g/ml-10g/ml,优点：操作比较简单，采用单一试剂4,4-二羧2,2-二喹啉(BCA)，终产物稳定，抗试剂干扰能力较强；需时2h或过夜缺点：反应时间长,原理：蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和
35、色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，在280nm处具有最大吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比关系,4、紫外分光光度法,用于原液比活性试算和成品规格控制测定范围：0.10.5mg/ml；微管中最低可检出0.1m1（0. 05mg）优点：快速，直接测定不需要标准品，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。缺点：不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的Pr无法检测；样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰,原理：在定性分析的基础上在，将S配成不同的标准，绘制S浓度与峰高/峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测T的峰高/峰面积，即可得T的浓度优点：具有定量精确，灵敏度高，重复性好
36、，自动化程度高等特点缺点：需要同种蛋白质做标准品,5、HPLC法/RP-HPLC法,6、生物检定法,蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法生物检定法有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性在体分析：胰岛素的小鼠血糖法离体组织（细胞）分析：缩宫素 的大鼠离体子宫法,SDS-PAGE-CBB G250染色-比色法：结合Lowry法等总蛋白质含量的测定，可用于复杂的蛋白混合物中目标蛋白质的定量测定ELISA法：为特异蛋白含量测定方法，具有特异性强，灵敏度高，同时测定样品多等
37、特点，可用于生产过程中目标蛋白质含量的测定,7、免疫分析法,利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物，再以比色予以定量免疫分析法与生物检定法具有一定的量效关系及相关性，提示它可部分地反映药物的生物活性临床药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法,重组制品原液蛋白质量少，纯度高，可用Lowry法或Bradford法测定蛋白质含量细胞因子蛋白含量正逐步采用HPLC法，HPLC法测定蛋白质含量能够排除溶剂系统的干扰，特别适用于进行批与批之间的质量控制,五、残余杂质检测,（一）宿主相关杂质1、宿主细胞蛋白(HCP)含量（Chp附录C）样品：原液、成品方法：双抗体夹心法（用HA
38、S作保护）宿主蛋白标准品：中检院提供标准：大肠杆菌0.01%、CHO0.05%,2、宿主细胞DNA含量（Chp附录B）,样品：原料药、制剂方法：DNA点印迹杂交法（地高辛标记）DNA标准品：厂家提供标准：DNA含量10ng/剂量,3、细胞内毒素（Chp附录E）,样品：原液、成品方法：鲎试剂分析法鲎试剂标准品：中检院提供标准：内毒素含量10EU/剂量,工艺相关杂质：残余抗生素、蛋白A产品相关杂质：多聚体、不同PEG修饰产物,六、安全性及其他检查,1、无菌试验：平皿法、需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体2、热原试验：鲎试剂法或家兔法3、异常毒性试验：小鼠（1ml）或豚鼠（5ml）腹腔注射4、水分、装量、
39、pH,第三节 应用实例,一、鲑鱼降钙素,照（附录1）鲑鱼降钙素生物检定法测定。测定效价应为标示量的80125，误差可信限在64156之间。本品的效价每毫克不得少于4000IU/mg。,1、含量（效价）测定,引起动物低血钙反应：本品的水溶液经腹部皮下直接注射于大白鼠，可检测到大鼠血钙降低（附录1）。薄层层析法：取本品供试品和鲑鱼降钙素标准品，临用前用0.1mol/L的醋酸溶液分别配成0.2%w/v的溶液。照薄层色谱法测试。 氨基酸检查：本品中的氨基酸应含有以下“氨基酸组分分析项”中所列氨基酸， 不含天然氨基酸丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。,2、鉴别,紫外吸收光谱： 照紫外分光光度法测定，在
40、250280nm波长范围内扫描，应在2751nm波长处有最大吸收，按肽含量计算最大吸收度应在0.400.55范围，最大吸收度与254nm波长的吸收度比值不低于1.6。氯离子：照氯化物检查法检查，与5.0ml标准氯化钠溶液（10g/ml）制成的溶液比较不得更深（小于7）。,3、检查,4、有关物质,有关物质：照（附录VF）薄层层析法或电泳法测定有关物质的含量不应超过5，供试品的次级斑点应不得超过标准品的次级斑点。 醋酸、水份含量及醋酸和水含量总和：本品为鲑鱼降钙素的醋酸盐，产品中含有一定量的醋酸和水。,二、重组人胰岛素,1、性状,本品为白色或类白色的结晶性粉末。在水乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和
41、稀氢氧化钠溶液中易溶。,2、含量（效价）测定,HPLC法：照高效液相色谱法(附录D)测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算小鼠血糖法：量反应平行性法比活性大于27.5IU/mg,3、鉴别,HPLC法：在效价测定项下记录的HPLC色谱图中，供试品主峰的保留时间应与重组人胰岛素对照品峰保留时间一致。肽图谱分析：V8酶水解供试品和对照品溶液。照效价测定项下的方法记录HPLC色谱图中，供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致。,人胰岛素赖脯胰岛素谷赖胰岛素门冬胰岛素甘精胰岛素地神胰岛素,4、检查,纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度大于99.0%。有关物质：照效价测定项下的
42、方法记录色谱图，按面积归一化法计算，总有关物质不得过3.0。高分子蛋白质：照高效液相色谱法(附录D)测定，以胰岛素单体-二聚体为对照品，以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高与二聚体峰高之比作为分离度，供试品溶液色谱图中显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不得大于对照溶液主峰的峰面积(1.0)。,细菌内毒素：依(附录 E)采用鲎试剂法检查，每1mg重组人胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。宿主细胞蛋白：采用ELISA法测定，每1mg重组人胰岛素中宿主细胞蛋白不得超过10ng。宿主细胞DNA:采用定量PCR法测定，每剂量重组人胰岛素中宿主DNA不得超过10ng卡那霉素：采用ELISA法测定，重组人胰岛素中卡那霉素不得超过10PPM。,锌：照分光光度法（附录 A），在620nm的波长处分别测定吸收度，计算。含锌量不得过1.0。氯：照氮测定法（附录 D 第二法）测定，按干燥品计算，含氮量应为14.516.5。,
