1、有梦想，才会有创造！,生物种间杂交想像图,已成功的动物细胞融合实例有很多，如人小鼠、人兔、人鸡、鼠兔、鸡鼠等上百种融合细胞。甚至已成功完成了酵母菌鸡 、人胡萝卜 等细胞的融合。,一、植物细胞杂交过程,二、动物细胞融合,三、多克隆抗体,1.单克隆抗体的制备,2.单克隆抗体的优缺点,3.单克隆抗体的应用,主 要 内 容,四、单克隆抗体,原生质体融合,杂合的原生质体,再生出细胞壁,杂种细胞,脱分化,再分化,愈伤组织,杂种植株,一、植物体细胞杂交过程,纤维素酶、果胶酶,1970年，有两位科学家做了一个人鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜的流动性。那么，如何实现人鼠细胞的融合，动物细胞融合后还有什么用途呢？
2、,人-鼠(想像图),二、动物细胞融合,1.概念：,动物细胞融合（cell fusion）也成细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为杂交细胞。,2、原理：,细胞膜的流动性,有些细胞的融合是正常的生命活动，如精子与卵细胞的结合。,3.诱导方法：,物理方法：,化学法：,生物法：,灭活的病毒,离心、振动、电激等,聚乙二醇（PEG),为什么灭活的病毒能作诱导剂？不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,4.融合过程,为什么灭活的病毒能作为诱导剂？不灭活的病毒能作为诱导剂吗？,生物法：,灭活的病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,
3、仙台病毒,紫外线,两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的,4.意义：,突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,5.应用：,最重要的用途是制备单克隆抗体,植物细胞杂交与动物细胞融合的比较,细胞膜的流动性 细胞的全能性,细胞膜的流动性,纤维素酶、果胶酶,胰蛋白酶,物理方法（离心、振荡、电激） 化学方法（PEG）,物理、化学方法 灭活的病毒,去除细胞壁后诱导原生质体融合,使细胞分散后诱导细胞融合,定义： 采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离血清，所获得的抗体即为多克隆抗体。 无论是细菌抗原，还是病毒抗原，
4、均由多种抗原成分组成，因此进入机体后可激活多种淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原成分或抗原决定簇的抗体，由此获得的抗体实际是一种多克隆的混合抗体。,三、多克隆抗体,什么叫克隆？2.什么叫抗体？抗体由何种细胞产 生？如何产生？3.抗体的化学本质是什么？ 与抗原作用的特点？ 主要分布在哪里？4.用传统的方法如何获得抗体？,四、单克隆抗体,抗体的传统生产方法,从血清中分离抗体,该法制备抗体的特点： 产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。,多种效应B细胞,动物体内,多种抗体,抗原,单克隆抗体McAb（概念）,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性
5、质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,那么，如何大量获得化学性质单一、特异性强的抗体？（即单克隆抗体）,1.单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备技术发展,1975 年德国科学家Kohler 和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B 淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术，由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984 年的诺贝尔医学和生理学奖。1994年Winter 等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步， 该技术是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，使不经免疫既可获得任何一种动物（包括人）的特异性抗体成为可能
6、，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。,单克隆抗体技术的基本原理,小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B 淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力, 可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖, 从而分泌大量单克隆抗体。,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖,杂种细胞,动物细胞培养技术,设计方案,动物细胞融
7、合,单克隆抗体,既能产生特异性抗体，又能大量繁殖,过程,注射抗原,细胞融合、筛选,筛选，继续培养,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,选择性培养基,选择性培养基作用：使亲本细胞和具有同种核的杂交细胞不能存活而杂交瘤细胞可存活,诱导其融合的方法有哪些？,抗体检验阳性,细胞系（无限繁殖),单克隆抗体制备过程,单克隆抗体的制备,为什么用HAT培养基可筛选出杂交瘤细胞？,HAT选择性培养基,制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），在这种选择性培养基中，由于变异
8、的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。,如何进行杂交瘤细胞的抗体 检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来
9、选择。 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,有限稀释法 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使 每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。,阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进
10、行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,2.单克隆抗体的优缺点,总之：特异性强、灵敏度高，产量大,(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。 (2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。 (3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。 (4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。,优点：,(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限
11、制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。 (3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。,单克隆抗体的局限性,化疗是治疗癌症的常用手段。但是化疗药物在杀死癌细胞的同时会破坏正常细胞产生巨大的副作用。如何在早期对癌症进行检测和筛查？如何能让药物只作用于癌细胞？,3.单克隆抗体的应用,3.单克隆抗体的应用,（1）作为诊断试剂准确识别各种抗原物质，并与抗原特异性结合，最广泛应用。 准确、高效、简易、快速,单克隆抗体运载抗癌药物，形成“生物导弹”（分子靶向治疗），治疗肿瘤。,（2）运载药物
12、和治疗疾病,生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤,(“生物导弹” 单抗导向，药物为弹头),“生物导弹”为人类攻克癌症提供了新的希望，但到目前为止只在少数癌症的治疗中有成功的范例，相信在不久的将来，因为我们的不断探索，人类最终会解决这一难题！ 目前，如何提高抗体的生产效率，同时保持其优良特性，且能同时解决免疫原性这一问题，是该领域的热点和难点，相信不久的将来，随着重组DNA 技术的进一步发展，可以根据不同需要实现人-人、人-动物、人-植物和动物-动物等多种抗体重新组合，借助于杂交瘤细胞产生嵌合抗体、重组型抗体、单链抗体、单区抗体、全套抗体以及抗体酶，将单克隆抗体的生产效率、质量以及应用提升到一个更高的水平。,展望,谢谢！,请大家批评与指正！,
