1、第二章 受精,受精（fertilization）是两性生殖细胞融合产生具备双亲遗传潜能新个体的过程，是新个体的开始.1.将父母的基因传给子代2.在卵母细胞质中激发一系列确保发育正常进行的反应卵母细胞成熟，精子的获能，精卵的识别，受精过程中的重要反应，卵新陈代谢的激活,第一节 精子和卵子的结构,精子通常分头部、颈部和尾部三部分.头部：细胞核和顶体颈部：近端中心粒到远端中心粒尾部：分三部分1. 中段：从基粒到环2. 主段：最长，负责运动3. 末段：5-7m。,卵子细胞质内物质分布不均，卵黄小板在植物极聚集浓缩，糖原颗粒、核糖体、内质网和脂质等移向动物极。细胞膜下高尔基复合体形成皮质颗粒。卵子成熟的
2、形态标记是卵母细胞核膜破裂（又称生发泡破裂;germinal vesicle breakdown，GVBD）.,第二节 卵母细胞成熟和排放,多数动物的长足卵母细胞长期停止于第一次减数分裂双线期，在适当信号刺激下恢复减数分裂，到第二次减数分裂中期停止，成为等待受精的成熟卵。在外源信号作用下卵母细胞成熟。诱发卵母细胞恢复减数分裂的信号：海胆，1-甲基腺嘌呤；两栖类，孕酮；哺乳类，4,4-二甲基-5-胆甾基-8,14,24-三烯-3-酚(简称FF-MAS)。卵母细胞成熟的标记：生发泡破裂，染色体聚集，纺锤体形成和第一极体排出。在分子水平变化：细胞内cAMP浓度下降, Ca2+浓度上升，蛋白质合成增加
3、 (磷蛋白pp39mos，促成熟因子MPF)排卵(ovulation)：在体内外诸因素(环境，神经，激素，酶等)作用下卵子由卵巢排出. 只有适当成熟的卵子才能受精.,长主卵母细胞由依赖cAMP的PKA 磷酸化的蛋白质控制（因外源信号能迅速导致卵母细胞cAMP含量下降），停顿在第一次减数分裂的双线期。该蛋白去磷酸化之后，卵内蛋白质合成增加。启动卵母细胞成熟分裂恢复的活动发生在细胞周期的晚G2相。由外源信号导致卵母细胞cAMP含量下降.在翻译的蛋白合成产物中，最引人注目的是pp39mos和MPF。长足卵母细胞质中贮存着母型c-mos mRNA，经外源信号刺激，母型c-mos mRNA加poly(A
4、)尾，由此翻译出相对分子质量3.9 X 104的磷蛋白pp39mos 。该蛋白只在成熟过程中出现，受精后迅速降解.pp39mos具恢复卵减数分裂并使之停顿在第二次减数分裂的作用，但必须与Cdk2共同作用才能实现。细胞静止因子(cytostatic factor,CSF) 由pp39mos和Cdk2组成 .,MPF由调节亚基Cyclin B与催化亚基p34cdc2组成，其活化不依赖卵母细胞的转录水平的活动，依赖于翻译水平的活动。Cyclin B是一种周期性合成和降解的蛋白质，对p34cdc2的去磷酸化和磷酸化具调节作用。Cyclin B与预存在卵中无激酶活性的p34cdc2结合在一起，形成低活性
5、的MPF前体。在磷酸酯酶(cdc25基因产物)作用下，MPF前体中p34cdc2的Thr一14和Tyr一15被去磷酸化, Thr - 161保持原有被磷酸化的状态，成为具激酶活性的MPF。活化的MPF具自我扩增作用，即通过(间接)活化Cdc25进一步使更多的MPF前体活化。在一定量的MPF作用下，细胞即可跨入M相.,随着受精，受精卵内游离Ca2+增加，钙调蛋白激活，使依赖钙调蛋白的酪蛋白激酶II (CKII ) 活化。随着CKll的活化，c-mos基因产物pp39mos降解，Cdc2激酶失活，导致CSF解体，受CSF保护的CyclinB降解，细胞周期就此由M相跨入G1相.,不同动物卵子排出时的
6、状况：,各种动物所排出的卵子的成熟阶段不一致，大致有四种情况:受精在生发泡破裂之前，即处于初级卵母细胞时期，精子入卵后才完成两次减数分裂。如海绵、蛔虫、沙蚕、箭虫等.受精在第一次减数分裂中期。例如贻贝、玻璃海鞘、毛翼虫、蛤等。受精在第二次减数分裂中期。如绝大多数脊椎动物和文昌鱼受精在已经完成两次减数分裂之后.例如海胆、腔肠动物等.有时把称为中间型。另外，以上划分并不十分严格，有许多例外，如海胆在受精过程中发现以上四种情况都有.,第三节 精子的获能,新射出的精子不能受精卵子，必须经过获能(capacitation)。获能是精子在生殖道获能因子作用下发生一系列变化获得受精能力的过程。其中的激酶(获
7、能因子)有依赖 cAMP 的 PKA，磷脂激活的蛋白激酶（PKC）和酪氨酸激酶。1. PKA：在小鼠精子获能期间，腺苷酸环化酶活性和cAMP 合成均增加，PKA的两种不同成分 PKI 和 PKA的调节亚单位可抑制获能反应。2. PKC：参与精子运动和顶体反应，用phorbol ester (佛波酯)刺激PKC可加速精子获能。3. 酪氨酸激酶：用磷酸化酪氨酸抗体发现小鼠精子中3种不同的磷酸化蛋白：52kDa、75kDa和95kDa。后两种只在获能精子中磷酸化，为获能专一的标记物.,源于雄性生殖道的受精促进肤受精促进肤(fertilization promoting peptide , FPP)在
8、精子获能中起一定作用。FPP是前列腺分泌的三肽。将FPP加入到未获能的小鼠和人精液中，可实现获能反应和提高受精/穿透能力。FPP尚可抑制精子顶体的丢失，使精子维持较高受精能力腺苷( adenosine)能调节腺苷酸环化酶的活性，对获能和未获能的两种精子产生的作用与FPP的作用相似。FPP结构上与促甲状腺素释放激素( thyrotrophin一releasing hormone, TRH)相似，与TRH 抗体有交叉反应。哺乳动物前列腺和精液中含TRH类似物，从兔前列腺中已分离出TRH类似物。FPP可以诱发与精子相关的生物学反应，可以最大限度保持精子的受精能力。,第四节 精卵的识别,精卵识别有距离
9、识别和接触识别距离识别见于体外受精动物的向化性距离识别效应；接触识别中精子与滤泡细胞、透明带(zone pellucida，ZP)和卵黄膜在三个独立的水平精确的相互作用，其中精子与透明带相互作用为专一的反应，可诱导顶体反应(acrosomal reaction).顶体反应的作用在于释放顶体内的酶和使精子膜成分重新分配、暴露或被修饰。精卵不仅互相粘附，同时进行融合，并诱发卵中的一系列信号转导，导致生物学事件发生.一. 精子的向化性：许多动物卵母细胞在完成第二次减数分裂后释放物种特异的向化因子。海胆卵胶膜中分离出含14个氨基酸的精子激活肽resact，可吸引精子.二. 具受体功能的精子表面蛋白：已
10、发现动物精子在与透明带糖蛋白结合中存在起受体作用的精子表面蛋白。主要有：,1. 半乳糖基转移酶(GalTase)：精子和体细胞均表达，是细胞表面的，末端具有N-乙酰葡萄糖胺的寡糖苷配体的受体。活精子表面的GalTase能选择的与ZP3 (精子结合蛋白)作用，将半乳糖特异的转移到ZP3。GalTase与其配体结合，能激活精子的G蛋白并诱导顶体反应2. SP56（透明带附着分子，半乳糖结合蛋白）：位于顶体完整精子的头部，能与ZP3结合，可能结合ZP3上寡糖的一种外源凝集素. 是一种睾丸独有的细胞膜蛋白.3. P95：能与ZP3结合，特点是它的酪氨酸被磷酸化。小鼠 p95 与 ZP3 结合将激活 p
11、95 中酪氨酸激酶活性启动一连串信号，导致顶体反应。精子与透明带的相互作用，诱导顶体反应，释放顶体内的酶类和使精子膜成分重新分配、暴露或被修饰。精卵不仅互相黏附，同时进行膜融合，并引发卵内一系列反应，使卵被激活.,第五节 受精过程中的重要反应,一.顶体反应(acrosomal reaction)精子与卵子表面接触或与卵膜分泌的物质相遇后精子顶体发生一系列变化，即顶体反应顶体反应先从顶体排出内含物，然后伸出长短不一的顶体丝(acrosmal filament)与卵膜接触，释放内含物溶解周围卵膜，形成一通道.,1. 精子与透明带的初级结合已获能精子可穿过卵丘层到达透明带与之结合发生顶体反应。从小鼠
12、透明带中分离出一种83kDa的糖蛋白（ZP3), 当精子与其孵育后可抑制它与透明带的结合，另外两种糖蛋白ZP1和ZP2并不抑制这种结合。现已证明精子和透明带结合的关键是ZP3糖蛋白上的终端半乳糖。精子表面具有三种结合透明带的蛋白质：结合ZP3半乳糖残基的56kDa的蛋白质、精子蛋白(一种糖基转移酶)和一种精子蛋白酶。,2. 精子与透明带的次级结合顶体反应期间精子前部的细胞质膜从精子中放出, 这是与ZP3结合的蛋白质位点。精子保持与透明带结合以便溶解出一条穿过的通道.小鼠精子次级结合透明带由内顶体膜上的蛋白质完成，它特异地结合于ZP2，顶体完整的精子不能结合ZP2。(透明带的结构是由重复的ZP2
13、和ZP3单位组成，偶尔有一个ZP1插入) (右图)。顶体反应过的精子与透明带的结合从ZP3转移到相邻的ZP2 分子上.猪中结合于ZP2的好象由原顶体粒蛋白(proacrosin)调节，它结合于透明带，此后变成一种蛋白酶顶体粒蛋白(acrosin)，可局部消化透明带.,3. 顶体反应的调控机制1)离子调控 Ca2+起主导地位。哺乳动物精子中，钙主要分布于顶体区、顶体后区的顶体外膜表面，及精子质膜内表面，Ca2+贮存区是顶体反应的激烈区。膜上有Ca 2+泵、Na + / Ca 2+交换器和钙离子通道3个Ca 2+转移系统参与调控细胞内Ca 2+浓度。 Ca 2+内流是早期顶体反应的关键，在小鼠、猪
14、、牛、豹中已获证实。Ca 2+内流依赖于Na + / Ca 2+交换 。除Ca2+的调控以外，K+ 、Mg2+、CI-、H+也对顶体反应起调控作用Ca2+内流可导致H+外流，使精子内部pH升高，诱发顶体反应2)脂质调控 脂质在精子顶体反应中调控膜的流动性和“钙泵”的活性。牛和豚鼠精获能后，顶体外膜和精子质膜上的溶血卵磷脂含量下降，而卵磷脂含量升高。卵磷脂是由溶血卵磷脂酸产生，并依赖于Ca2+和磷脂酶A2作用产生溶血化合物，导致脂膜溶解，并发生胞吐作用。,3)磷酸肌醇调控 多磷酸肌醇的产物是诱发顶体反应的第二信使多磷酸肌醇在磷脂酶C (PLC)的作用下，产 生4,5 -磷酯酰肌醇二磷酸( PIP
15、2 ) 。PIP2被PLC 水解，产生二酰甘油(DAG)和1,4,5一三磷酸肌醇( IP3 ) 在 IP3作用下，细胞内非线粒体贮存的Ca 2+释放，细胞内Ca2+的水平提高，激活顶体反应所需的关键酶；第二信使DAG，它活化PKC，后者使蛋白磷酸化，诱导顶体反应,二. 皮层反应(cortical reaction),精子与卵子接触，卵就开始发生一系列深刻变化，为卵子激动(activation), 首先是皮层变化, 即皮层反应. 此从精子入卵点开始，然后波及整个皮层.在精卵接触点皮层颗粒首先破裂，内含物（糖蛋白类）排出，一部分与卵外卵黄膜形成受精膜，其余保留在受精膜和卵之间的卵周隙中，吸水使受精
16、膜举起。受精膜形成和卵周隙出现可防止后到的精子进入，防止多精受精.,海胆和小鼠精子和卵子质膜的融合,三. 多精受精的快阻断,由卵膜的电变化引起，反应快.海胆卵在海水中，细胞外具有特高的钠离子, 细胞质含有相对少的游离钠，钾离子情况正相反。静止膜电位(resting membrane potential)为70 mV.当第一个精子结合后1-3秒，钠离子内流，膜电位变成+20 mV。此时精子再不能与卵子结合，阻断第二次受精，此为多精受精的快阻断。这种阻止多精受精过程短，且简短的电位变化不足以最终阻止多精受精,四. 多精受精的慢阻断,海胆多精受精快阻断持续1分钟。除去卵表面的多余精子，由皮质颗粒反应
17、(cortical granule reaction)完成. 是一种慢的、机械的、在精卵接触后1分钟变活跃的反应。海胆卵膜下面有15000个1m的皮质颗粒，内含透明素、蛋白酶、过氧化物酶和粘多糖类。精子入卵处皮质颗粒破裂，并向周围扩展引起更多皮质颗粒破裂，释放内含物到卵质膜和卵黄膜间，其间的蛋白质被蛋白酶溶解。粘多糖吸水使卵黄膜举起成为受精膜(fertilization envolpe) .蛋白酶修饰或完全除去结合蛋白受体以及与其接触的精子。过氧化物酶使受精膜变硬。同时卵内储存钙释放，钙离子直接负责皮层反应扩展。完全防止多精受精.,第六节 遗传物质的融合,精与卵膜融合：精子核和中心粒与线粒体和
18、鞭毛脱离并入卵，精子核解浓缩成雄原核(male pronucleus)。卵核变为单倍体雌原核(female pronucleus).雄原核入卵后旋转180，中心粒位于雌雄原核之间, 两个原核彼此相向运动，融合形成二倍体的合子核。,人类受精过程中雌雄原核的运动,哺乳动物雌雄原核在遗传上被认为是相等的，但研究提示在功能上可能不同(右下图)。 如子宫瘤(水疱状胎块) 是单倍体精子受精缺少雌原核的卵形成的。同样孤雌生殖或卵二倍体形成的胚胎具有脊髓、肌肉、骨骼和器官，包括跳动的心脏。但在11-12天(小鼠妊娠期的一半)停止发育.,第七节 卵新陈代谢的激活,成熟卵在代谢上是一个惰性的细胞，被精子入卵重新激
19、活.启动一系列预定的代谢事件，如海胆：精卵结合 0秒受精卵电位升高 3秒以前精-卵膜融合 30秒以前第一次钙离子增加 30秒皮质泡的泡吐作用 30-60秒NAD酶激活 开始于1分钟NADH和NADPH增加 开始于1分钟精子进入 1-2分钟H+ 离子流出pH升高 1-5分钟精子染色质解浓缩 2-12分钟精子核移向卵中央 2-12分钟卵核移向精子核 5-10分钟激活蛋白质合成 开始于5-10分钟激活氨基酸运输 开始于5-10分钟起始DNA合成 20-40分钟有丝分裂 60-80分钟第一次卵裂 85-90分钟,受精后卵内的细胞质重排,仓鼠的受精过程图解,受精的条件和因素,1. 精子的活动和受精力：精
20、子缺乏细胞质和营养物质，但却很活跃 (人精每秒运动35-50m；牛精120 m/S；大鼠精70m/S)，离体后生命较短暂(几分钟-几天)，即使有活动能力(人精48-60小时; 牛精96小时; 大鼠精17小时)，已丧失受精能力(人精和牛精保持24-48小时；大鼠精14小时)。2. 精卵合适的成熟度。3. 精卵释放物：精子和卵子释放具有明显效应的物质相互吸引，通常具种的特异性。卵子的卵黄膜和卵膜也相关。,4. 精子的数量：哺乳动物行体内单精受精, 每次射出的精子量极多，羊20-100亿；牛40-100亿；猪200-800亿；人2-3亿。但到达受精地点输卵管的精子有限，羊仅有数百个。体外实验证明，小鼠精子密度与受精率正相关。统计显示：50年(1940-1990)受环境、工作等因素影响，人射精容积由3.4ml下降到2.75ml，浓度由1.13亿/ml下降到6600万/ml，减少53%。 5. 环境温度，pH，离子等均能影响受精的正常进行。,
