1、第八章 化学毒物的一般毒性作用,7/12/2018,1,7/12/2018,2,要求 了解LD50的计算方法、化学毒物所致机体损 伤的组织学改变及其评价。 2. 熟悉蓄积毒性作用及其评价；急性、亚慢和慢性毒性试验设计及评价。 3. 掌握急性、亚慢性和慢性毒性试验的基本概念、染毒途径。,7/12/2018,3,几个概念： 化学毒物、毒物与非毒物一般毒性作用（general toxicity）： 在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒性效应（又称为基础毒性basic toxicity ）。 按接触毒性时间的长短，一般毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。,7/12/201
2、8,4,1 急性毒性作用及其评价 2 蓄积毒性及其评价 3 亚慢性和慢性毒性作用及其评价,7/12/2018,5,1 急性毒性作用,一、急性毒性概念和急性毒性试验的目的二、急性毒性试验三、急性毒性评价（分级）,7/12/2018,6,一、急性毒性概念和急性毒性试验的目的,急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应，包括一般行为、外观改变、形态变化以及死亡效应。 试验动物的染毒途径不同，一次接触的含义也有所不同。,7/12/2018,7,7/12/2018,8,急性毒性试验(acute test)是指机体(人或试
3、验动物)一次给与或24小时内多次给予受试物后，短时间内动物所产生的毒性反应，包括致死和非致死的指标参数。,目的测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。,7/12/2018,9,7/12/2018,10,探求化学毒物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。为毒理学机制研究提供线索 。,急性毒性试验常用的
4、毒性参数：LD50（LC50）Zac （LD50/Limac）LD84/LD16(或LC84LC16) 剂量反应曲线斜率,7/12/2018,11,二、急性毒性试验,(一)试验动物原则：急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。（最基本和重要的原则）动物易于获得品系纯化价格较低和易于饲养等条件。,7/12/2018,12,1试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。,7/12/2018,13,试验动
5、物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,7/12/2018,14,3.试验动物的性别：急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,7/12/2018
6、,15,4.动物数量与随机分组：大、小鼠等小动物 每组10只狗等大动物 每组6只分组原则随机化原则（了解）,7/12/2018,16,7/12/2018,17,5.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h大动物每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。,7/12/2018,18,6.实验动物的预检：选择健康动物12周的检疫期,（二）试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格,7/12/2018,19,（三）染毒途径的选择: 染毒途径（exposure routes）的选择需考虑：模拟人在
7、生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮特殊情况下也可采用注射途径。,7/12/2018,20,经口(胃肠道)接触 : 灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g 大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 吞咽胶囊: 经呼吸道接触 : 静式吸入 动式吸入 经皮肤接触 :注射途径接触:,7/12/2018,21,（四）染毒剂量与分组: 1查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸
8、点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。,7/12/2018,22,7/12/2018,23,1查阅文献确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂 量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。,2预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。根据确定的剂量组进行染毒。根据预试验的死亡资料确定组距。,7/12/20
9、18,24,7/12/2018,25,可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。,3正式试验; 一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设610个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2
10、i LgLD0+3i LgLD0+4i ,7/12/2018,26,（五）试验周期与毒效应观察,7/12/2018,27,试验周期：一般以两周为宜,7/12/2018,28,毒效应观察1.中毒症状,2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾能功急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便
11、了解受试物引起毒效应的持续时间。,7/12/2018,29,3.病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。,7/12/2018,30,4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为
12、深人研究化学物的毒作用机制提供参考。,7/12/2018,31,三、急性毒性评价,7/12/2018,32,7/12/2018,33,7/12/2018,34,LD50为了便于比较化学物的毒性及有毒化学物的管理，国内外根据LD50值大小提出了许多急性毒性分级标准。LD50值是一个常用的急性毒性评价指标，但不能表示急性毒性的全部内容：1）以死亡作为观察指标；2）是一个统计学估计数值。比较不同外来化学物的LD50或比较同一化学物不同实验室所测定的LD50值时，要注实意验条件的同一性和量概念的等效性，需要检查完整的剂量-反应关系资料。,7/12/2018,35,LD50值的95%可信限，剂量-反应曲
13、线的斜率及动物急性致死的时间都是剂量-反应关系资料内容。斜率小时，在剂量低于LD50值时，致死作用大于斜率大的毒物。致死效应发生的时间越短，危害越大。,7/12/2018,36,同一化学物的LD50值在不同实验室的测定结果可有4-7倍； LD50相似的两种物质，不同的致死剂量范围内致死毒性不定相同； LD50不同时，致死毒性不定有明显差别。,7/12/2018,37,LD16与LD84用于弥补LD50的不足。用曲线表示剂量与死亡率之间的关系时，LD16与LD84的比值呈现一种两端平直、中间陡峭的S形曲线，其转折点相当于动物死亡率16和84。LD16与LD84正好是致死剂量反应曲线的直线部分，即
14、与动物死亡率的概率单位4.0和6.0相当，也是LD50值的16的值。（P27面，图1-2）急性毒作用带（Zac）带越宽，危险性越小。,7/12/2018,38,1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值，不能用来 表示急性毒性的全部内容。4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的 症状观察是不够的，更需要的是生理学、 血液学及其它化验检查所提供的深入细致 的毒性信息。,经典急性毒性试验的局限性,7/12/2018,39,评价时需要考虑的其它指标和参数： 剂量-反应曲线的斜率 动物急性致死的时间 化合物LD84 和LD16 化合物的急性毒作用带,7/12/2018,40
15、,LD50的计算方法：寇式法和改进式寇式法概率单位-对数图解法霍恩法,2 蓄积毒性作用及其评价,一、基本概念二、 蓄积毒性试验方法及其评价,7/12/2018,41,一、基本概念, 蓄积作用（accumulation)：当化学物 与机体发生亚慢性接触，将反复进入机体，而且当进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化学物就有可能在机体内逐渐增加并贮留的现象,7/12/2018,42,贮存库 铅（Pb）-骨骼 镉（Cd）-肾脏 DDT、TCDD等-脂肪组织,7/12/2018,43,易蓄积的部位称为贮存库。常见的贮存库有血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏及骨骼。化学物的贮存形式有：母体、结合
16、态、转化态。,7/12/2018,44, 蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础 耐受性是蓄积性的另一种表现形式之一，甚至可能隐藏着潜在的慢性中毒 一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据,蓄积作用实际上有二个含义： 物质蓄积(material accumulation) 功能蓄积(functional accumulation),7/12/2018,45,7/12/2018,46,物质蓄积： 实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够测得机体内存在该化学物或其代谢产物,7/12/2018,47, 功能 ( 机能 )
17、蓄积 ：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用,7/12/2018,48,功能蓄积可能是 由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积 或者是由于每次机体接触化学物之后所引起的损害累积所致,二、蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。,7/12/2018,49,7/12/2018,50,蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的
18、强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,二、蓄积毒性试验方法及其评价,(一)蓄积系数法 蓄积系数(accumulation coefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即：KED50(n)/ED50(1)KLD50(n)/LD50(1),7/12/2018,51,1固定剂量法： 一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。 先求出LD50，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。 试验组在120l
19、50LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。,7/12/2018,52,7/12/2018,53,当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算K值，然后依表65进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。,2剂量递增法：,7/12/2018,54,7/12/2018,55,在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，
20、即K5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。,3剂量固定的20天蓄积法： 它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20 LD50、l/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。,7/12/2018,56,7/12/2018,57,试验结束时根据下列标准进行评定： 各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显； 如仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性； 如1/20LD50剂量组无死亡，其他
21、各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性； 如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,(二)生物半减期法： 生物半减期(biological half-life，t1/2)是指进入机体的外源化合物由机体消除一半所需的时间。 用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。 t1/2以化合物在体内的数量为基础来表示蓄积性， 是表示外来化合物的蓄积性的重要指标。,7/12/2018,58,7/12/2018,59,根据摄入量、摄入时间间隔（t)和t1/2 ，可以估计蓄积情况。如果t t1/2,则蓄积可能减少；反之则可能蓄积。如果t= t1/2 ，也蓄积。无论化学物t1/
22、2长短,在与它等时间间隔接触化学物条件下，化学物都会蓄积，并且经过6个t1/2时，蓄积达到最大值。化学物继续进入机体，蓄积增加几乎为零。蓄积与清除达到平衡。蓄积极限值L(mg)=1.44化学物吸收量（mg/d） t1/2（d）。,7/12/2018,60,t1/2测定方法：将被检测物由静脉注入，然后按一定时间间隔连续多次测定机体接触受试物后试验动物血浆中该物质的浓度，以时间为横坐标，以血浆中物质浓度的对数值为纵坐标绘图，依图求出直线的斜率ke(即速率常数），生物半减期t1/2 0.693/ke。生物半减期较短的物质达到蓄积极限所需时间短，机体一旦停止接触该物质，也易于很快从机体消除。反之则不易
23、消除。,7/12/2018,61,（三）蓄积率及其测定,蓄积率：在一定时间内，外来化学物在体内的蓄积量与同一期间进入机体总量的百分比。测定方法：用两组条件一致的动物，试验组先每日给予一定剂量被检化学物，但动物不能发生死亡，以一定时间给予一定剂量后再与对照组同时分别测定该被检物的LD50。,7/12/2018,62,如果被检化学物在体内有蓄积性（蓄积率1），则由于蓄积试验组动物在进行LD50测定前，体内已蓄积一定数量，所以其LD50必定较对照组小。 两组动物之间测得的LD50之差认为是前一时期蓄积试验组动物体内的蓄积量。,7/12/2018,63,计算方法：蓄积率（%）（对照组LD50-蓄积试验
24、组LD50）/蓄积期间给予蓄积试验组动物被检物质总量100%,7/12/2018,64,现有蓄积试验都是以死亡为观察毒效应的指标，不引起死亡的可能得出弱蓄积性的错误结论。如氯丁二烯。如果在蓄积毒性试验时选用其它指标（如靶器官的损伤），求取ED50（n）和ED50（l），计算蓄积系数易得正确结论。,7/12/2018,65,关于机体耐受性,机体的耐受性：某一外来化学物反复作用于机体后，有时一些本来可以引起机体呈现一定剂量的效应，却没有引起反应，必须加大剂量才能使机体呈现预期效应。,7/12/2018,66,在蓄积试验结束时，将存活的动物给予一次冲击剂量（一般用一次LD50的剂量）后统计动物死亡率
25、与预先未经化学物处理的对照组的死亡率进行比较，以观察动物在小剂量长期染毒情况下是否出现对毒物的耐受性。耐受性是蓄积性的另一种表现形式。蓄积、耐受性与慢性中毒之间的关系是常要进一步研究的问题。,3 亚慢性和慢性毒性试验,一 亚慢性毒性作用： 亚慢性毒性的概念 亚慢性毒性试验的目的 亚慢性毒性试验的设计 二 慢性毒性作用： 慢性毒性的概念 慢性毒性试验的目的 慢性毒性试验设计,7/12/2018,67,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,(一) 概念： 亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人 或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(chro
26、nic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,7/12/2018,68,（二）试验目的： 1.确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱， 对在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用； 2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；,7/12/2018,69,7/12/2018,70,3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系，以确定外来化合物的毒性下限，即其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值;,7/12/2018,7
27、1,4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性; 5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据; 6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,（一）实验动物选择,7/12/2018,72,亚慢性毒性试验 年龄：大鼠80100g 狗 812月 小鼠1015g数量：小动物20 大动物6性别：雌雄各半,慢性毒性试验年龄：大鼠 5070g 狗 8月 小鼠 初断乳数量：小动物40 大动物8性别：雌雄各半,（二）实验动物染毒期限：工业毒理学 36个月食品毒理学 6个月1年环境毒理学 6个月1年致癌试验 接近或等于动物的预期寿命,7/12/2
28、018,73,7/12/2018,74,（二）实验动物染毒期限,经消化道经呼吸道经皮肤,7/12/2018,75,（三）实验动物染毒方式,亚慢性毒性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 急性毒性的阈剂量 1/201/5 LD50组距：310倍，最低不小于2倍,慢性毒性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 亚慢性阈剂量1/51/2 1/10 LD50组距：25倍，最低不小于2倍,7/12/2018,76,（四）试验分组和剂量设计,7/12/2018,77,（五）观察指标,1.一般综合性观察指标：外观体征、行为活动、体重、食物利用率2. 一般化验指标：肝肾功能和血象3. 系统尸解和
29、病理学检查：（1）脏器湿重、脏器系数（脏/体比值 ）（如肝/体比，即(全肝湿重/体重)100 ）（2）病理学检查4.特异性指标：,7/12/2018,78,（五）观察指标,7/12/2018,79,7/12/2018,80,三、亚慢性和慢性毒性作用评价,评价实验资料，首先确定毒效应。了解受试物毒性的大小及靶器官，并找出敏感的毒效应指标。慢性阈剂量（Limch）：最低有害作用水平（LOAEL） 或最小作用剂量（MED）最大无作用剂量：无明显作用水平（NOEL）或无明显 有害作用水平（NOAEL）,7/12/2018,81,根据亚慢性和慢性毒性试验的结果获得的LOAEL或NOAEL是评价外来化合物
30、引起生物体损害的主要指标，以此为基础可制定某种外来化合物的接触极限。,7/12/2018,82,经过对亚慢性试验资料的全面评价，确定毒效应及毒效应敏感指标或特异指标，根据阈剂量和最大无作用剂量，为慢性毒性试验选择观察指标和剂量设计提供可靠的基础。 经过对慢性毒性资料的分析，可阐明化学物慢性毒作用的特点、毒作用类型和主要的靶器官。根据敏感指标确定慢性阈剂量和最大无作用剂量，也可以求出基准剂量（BMD）。,7/12/2018,83,物质应用于食品的风险性评价最大无作用剂量 人群可能摄入量的50倍 毒性较强， 予以放弃人群可能摄入量的50倍 最大无作用剂量人群可能摄入量的100倍 需要相关专家共同评
31、议最大无作用剂量人群可能摄入量的100倍 可考虑允许使用于食品，并制定卫生指标,四、局部毒作用,1.皮肤原发性刺激试验2.皮肤致敏反应试验3.光致敏反应4.光刺激试验5.眼刺激试验6.其他粘膜刺激试验7.替代（体外）试验,7/12/2018,84,7/12/2018,85,什么叫蓄积系数？蓄积作用包括和两种。所有的外源化学物都有蓄积性。简述蓄积系数法的原理。13表示中等蓄积。什么叫生物半减期？如何测定生物半减期？假设每天摄入的某种色素0.1mg，该色素的t1/2=5(d)，它的蓄积极限值为多少？,复习,7/12/2018,86,什么叫蓄积率？它的测定原理如何？慢性毒性试验如果试验目的是测定受试物的安全限量标准，即卫生标准，一般设五个剂量组：、。亚慢性试验的时间是受试动物的生命大部分时间。,
