1、浙科版生物选修（1）生物技术实践IB模块,1-1什么是生物技术,生物技术=生物工程 应用自然科学及工程学原理，以微生物体、动物体、植物体或其组成部分作为生物反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。,1-2 传统生物技术,传统生物技术指主要通过微生物的发酵来生产商品.如:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等,1-3 现代生物技术,一般而言，現代生物技术可以分成以下五种：一、细胞工程二、发酵工程三、蛋白质工程四、酶工程五、基因工程,现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术中用到了基因工程。,一、细胞工程,按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传基础，并通过细胞(组织)培养，细胞杂交(
2、融合)，核移植和胚胎移植等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。,二、发酵工程,微生物的无氧呼吸叫发酵1.定义：利用DNA重组技术对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接及重新组合，再转入生物体內，产生出人们所期望的产物或创造出具有新的遗传特征的生物类型。,蛋白质工程主要包括了解合成蛋白质的DNA编码序列、蛋白质的分离纯化、蛋白质的序列分析和结构功能分析、蛋白质结晶和结构力学分析等。,三、蛋白质工程,酶工程即利用基因工程等手段，改变酶或蛋白质的折叠方式、空间结构、催化活性和稳定性等,四、酶工程,选修1需学习的实
3、验,（微生物的利用） 实验1 大肠杆菌的培养和分离 （酶的应用） 实验4 果汁中的果胶和果胶酶 实验5 加酶洗衣粉的使用条件和效果 实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 （生物工程在食品加工中的应用） 实验8 果酒及果醋的制作实验 实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定（浅尝现代生物工程） 实验11 植物的组织培养,实验1 大肠杆菌的培养和分离,第一部分 :微生物的利用,一、基础知识,1微生物,2培养基,3无菌技术,二、实验操作,2微生物的接种技术,1操作步骤,微生物包括哪五类：,病毒细菌和蓝细菌放线菌真菌原生动植物,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜
4、才能看到，有的甚至没有细胞结构.,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一基础知识,（一）微生物,1放线菌,1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,2病毒的结构,朊病毒（蛋白质病毒）,病毒的增殖：,3真菌,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,4细菌的外形与大小,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色（革兰氏染色）后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,细菌细胞由外向里依次有鞭毛
5、、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质、 拟核，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,细菌的构造,图 细菌的结构,细胞膜,拟核,*细胞壁,成分：肽聚糖细胞壁有哪些功能？ 固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞；,使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,菌落：,单个或少数细
6、菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,5细菌的营养物质,碳源 有机 、无机氮源 有机 、无机水无机盐生长因子 即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶,根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌:异养菌:腐生菌寄生菌 大部分病原菌,细菌的营养类型,光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌,（二）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（1）按物
7、理状态来分：培养基可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等，而液体培养基一般用于工业生产。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按化学成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,按物理状态来分,固体培养基：菌落，菌苔,按物理状态来分,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定,按物理状态来分,选择培养基,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳
8、有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞,按功能来分,鉴别培养基,伊红美蓝乳糖培养基,按功能来分,当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,按化学成分来分,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基
9、主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,按化学成分来分,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子； 激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,按化学成分来分,3.培养基内所含的基本物质,一般营养物质(1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐其他物质 pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，
10、而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 .,(2)碳源,可作为碳源的物质有:含碳无机物: 、 、含碳有机物：,蛋白质,脂肪酸,碳酸盐,碳酸氢盐,糖类（主要）葡萄糖 乳糖,二氧化碳,不同微生物所利用的碳源不同异养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为,含碳有机物（有机碳）,含碳无机物（无机碳）,(3)氮源,可作为氮源的物质有:含氮无机物： 、 、 、含氮有机物：,蛋白胨,牛肉膏,尿素,固氮微生物所利用的氮源是,氮气,氨气,硝酸盐,氨盐,氮气,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,不管哪种培养基
11、，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透压的要求,细菌喜荤，霉菌喜素,大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g 蛋白胨：0.5g Nacl：0.5g 琼脂： 1g 水:50ml,细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸,3培养基配制原则：,营养要协调目的要明确PH要适宜,（三）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；（4）避免已灭菌
12、处理的材料用具与周围物品相接触。,从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作,（）消毒定义：,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,是指杀灭病原微生物的方法。区分为高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三种方式。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 如牛奶的消毒3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒,(2)消毒的方法：,灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接
13、种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 而培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是
14、专为防止空气中微生物的污染而设计的。,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,思考,1,大肠杆菌的培养和分离,3.微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,二、实验操作,1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基2纯化大肠杆
15、菌3将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录,二、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,大肠杆菌的培养和分离实验操作,培养基的配置与灭菌,取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。,LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使菌进入,2、纯化大肠杆菌,接种方法有：划线分离法和涂布分离法,划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后
16、,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的接种技术,1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,8灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。 9倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污
17、染才可用来接种. 10无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板技术,平板划线的操作,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,1.旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2.是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本
18、一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养1224h,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用
19、手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,平板划线的操作,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,1.旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2.是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符
20、合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,（四）大肠杆菌的划线分离,注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养1224h,1、划线分离法,问题讨论,1.
21、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的
22、末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,4.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,5.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,涂布分离法,纯种的菌种稀释一般
23、采取最简单常规的稀释涂布平板法。 将菌种用接种环蘸取，放入培养液内进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养即可。,涂布分离法,(1)系列稀释操作:,涂布平板操作,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：方法简单，但单 菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分 开，但操作复杂。,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一,（五）大肠杆菌分离后保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?,(1)胆大心细
24、，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?,（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。,3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸
25、气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,接 种,【典例解析】,例1有关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都
26、提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面对发酵工程中灭菌
27、的理解不正确的是A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,答案：B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量
28、NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .,自养型微生物,含碳有机物,解释：过量食盐可用于培养金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌是异养型的。,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。,固氮微生物,3,调整pH,（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,8某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20种氨基酸中的一种）才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实验的目的，选用的培养基类型是（）注：亮氨酸链霉素“”加入“”不加入如：不加亮氨酸：加入链霉素,
