1、1本科毕业设计开题报告应用化学电化学发光法测定食品中四环素总量一、选题的背景与意义四环素类TETRACYCLINES,TCS抗生素分子式为C22H26N2O7，分子量43045，具有十二氢化并四苯基结构，是一种广谱抗菌药物。由于具备抗菌谱广以及价格低廉等优点,已被广泛应用于畜禽、水生动物和蜜蜂养殖中，用于预防和治疗多种感染性疾病、促生长、提高饲料转化率等。常用的TCS主要有四环素TETRACYCLINE,TC、金霉素CHLORTETRACYCLINE,CTC、土霉素OXYTETRACYCLINE,OTC、强力霉素DOXYCYCLINE,DC等。人们长期食用含有这类药物的动物产品及其制品，会严重
2、危及人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝、肾的损害以及对牙齿和骨骼的破坏，最显著的残留毒性是诱导耐药菌株的产生。因此许多国家和组织对TCS残留实施的最大残留值限定MAXIMUMRESIDUELIMITS,MRLS，如欧盟规定在肝脏中残留的MRLS为03MG/KG，牛奶或者肌肉中的MRLS为01MG/KG，蜂蜜中的MRLS为001MG/KG，美国食品药管局规定MRLS，在肌肉中为2MG/KG，肝脏中为6MG/KG，牛奶中为04MG/KG，我国规定动物源性食品中四环素抗生素的最大残留量为01MG/KG。因此建立一种快速，经济，准确的检测四环素类药物的残留方法是非常重要的。近
3、年来，国内外食品分析工作者十分关注四环素类药物残留检测技术，并建立了多种检测方法微生物法、色谱法，酶联免疫吸附法ELISA，化学发光法等。微生物法虽然原理及操作简单，但是测定所花时间太长、灵敏度低、特异性差，目前应用较少；色谱法灵敏度高011UG/L，准确性好，但样品前处理过程复杂、价格昂贵、分析速度慢等缺点，不适合于现场、快速检测分析；ELISA与化学发光法灵敏度较低，且抗干扰能力差。电化学发光ECL是一种利用电化学技术与化学发光方法相结合的技术。ECL具有装置简单、重现性好、可进行原位INSITU检测，且还具有高灵敏度和高选2择性等特点，目前相关研究已引起人们极大的兴趣，其中RUBPY32
4、/TPA为应用最广泛的ECL检测体系之一。崔华研究组研究发现四环素与土霉素可以抑制RUBPY32/TPA电化学发光，但从文献中可知其方法检测限还未达到欧盟的规定，也不能按照欧盟的标准检测四环素类药物总量的残留。本研究将基于TCS能增强RUBPY32的电化学发光的机理来测定食品中四环素含量。在目前检测TCS的方法中，未见定量限LOQ达到1010G/ML数量级的报道。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容确定实验条件。包括实验中所用的缓冲溶液、PH值和扫描电压、扫速等。确定各优化条件在实验中的作用，对PH值和缓冲溶液、扫速等决定性条件进行重点优化；建立实验方法。在的基础上，确定最终优化条件，
5、制定实验步骤，测定蜂蜜样品中四环素的总量，并通过数据处理得到该方法的灵敏度、精确度、准确度等数据。拟解决的主要问题优化实验条件，确定适当的缓冲溶液、PH值和扫速，达到可以直接用电化学发光法测定食品中四环素总量的目的，并探究其反应机理。三、研究的方法与技术路线方法查阅外文文献，结合本实验，拟定出需要优化的条件，主要为缓冲溶液、PH值和扫速。A缓冲溶液PBS、NA2CO3NAHCO3、BR、TRISHCLBPH值7、75、8、85、9C扫速10MV/S、30MV/S、50MV/S、70MV/S、100MV/S在实验过程中，对缓冲溶液、PH值、扫速进行优化。根据的结论，确定各条件对实验结果的影响，制
6、定实验步骤，分别对原始溶液（三联吡啶钌RUBPY32和缓冲溶液的混合液）、加有原始溶液的四环3素标准溶液、蜂蜜标样、蜂蜜加标样品、进行测定，从而得出该方法的灵敏度、精密度、准确度等数据，最终建立本方法。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月熟悉论文形式、内容，确定内容题目，并向指导教师询问。2010年12月查找并阅读有关食品中四环素总量测定方法的文献资料熟悉课题的研究方法。收集各种相关资料，进行分析、研究，完成开题报告书、综述等论文准备工作。2011年2月在导师指导下运用电化学发光的分析技术，建立定量分析食品中四环素含量的测定方法。2011年3月优化各项实验条件，应用电化学发光法测定
7、蜂蜜中的四环素。针对实验所出现的问题即使得以改进。2011年4月总结实验结果，撰写毕业论文。完成论文初稿，请指导老师指正和修改。2011年5月论文定稿，打印，并准备论文答辩。五、主要参考文献1COMMISSIONREGULATIONNO2377/90,OFFJEURCOMMUN18AUGUST1990NOL2242USCODEOFFEDERALREGULATIONS,TITLE21,PART556,SECTIONS150,500,AND720,USGOVERNMENTPRINTINGOFCE,WASHINGTONDC,2003CHAPTER13ANTIBIOTICRESIDUESINMILK,
8、DAIRYPRODUCTSANDANIMALTISSUESMETHODS,REPORTSAND优化缓冲溶液优化PH值优化扫速排除干扰物质四环素总量的检测方法电化学发光法测定蜂蜜样品中四环素的总量4PROTOCOLSNATIONALCENTREFORANTIBIOTICANDINSULINANALYSIS,FOODANDDRUGADMINISTRATION,DEPARTMENTOFHEALTH,EDUCATIONANDWELFAREWASHINGTON,DC,19684林修光,寇运同,贾臻,等用标准纸片法快速测定鸡肉中四环素族残留量J口岸卫生控制,2001,6319215戴栗洁土霉素生物检定条件
9、的改进J锦州医学院学报,2001,225346OMEGAFR,HERNANDEZA,AYILAGG,ETALINCREASEDMATRIXMETALLOPROTEINASEACTIVITYANDREDUCEDTISSUEINHIBITOROFMETALLOPROTEINASESLLEVELSINAMNIOTICFLUIDSFROMPREGNANCIESCOMPLICATEDBYPREMATURERUPTUREOFMEMEBRANESJAMJOBSTETGYNECVL,1996,17413717VALLEEBL,AULDDSZINCCOORDINATION,FUNTIONANDSTRUCTURE
10、OFZINEENYMESANDOTHERPROTEINSJBIOCHEMISTRY,L991,2956478WEINBERGMA,BRALMTETRACYCLINEANDITSANALOGUESATHERAPEUTICPARADIGMINPERIODONTALDISEASEJCRITREVORALBIOLMED,1998,93229MASTIMORIN,TSUKAMOTOT,MIYAON,ETALINHIBITORYEFFECTOFMINOCYCLINEONINVITROINVASIONANDEXPERIMENTALMETASTASISOFMOUSERENALADENOCARCINOMAJJU
11、ROL,1994,151140010PERESGT,RATHS,REYESFGRAHPLCWITHFLUORESCENCEDETECTIONMETHODFORTHEDETERMINATIONOFTETRACYCLINESRESIDUESANDEVALUATIONOFTHEIRSTABILITYINHONEY,FOODCONTROL,2010,21562062511UENOR,SANGRUNGRUANGK,MIYAKAWAMASIMPLIFIEDMETHODFORTHEDETERMINATIONOFSEVERALFISHDRUGSINEDIBLEFISHANDSHRIMPBYHIGHPERFOR
12、MANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYJFOODRESEARCHINTERNATIONAL,1999,32962963312中华人民共和国国家标准GB/T102520200513DEWASCHK,OKERMANL,CROUBELSS,ETALDETECTIONOFRESIDUESOFTETRACYCLINEANTIBIOTICSINPORKANDCHICKENMEATCORRELATIONBETWEENRESULTSOFSCREENINGANDCONFIRMATORYTESTSJTHEANALYST,1998,1239122737274114PANGYQ,CUIH,ZHENGHS,
13、WANGH,LIULJ,YUXFFLOWINJECTIONANALYSISOFTETRACYCLINESUSINGINHIBITEDRUBPY32/TRIPROPYLAMINEELECTROCHEMILUMINESCENCESYSTEM,LUMINESCENCE,2005,20181515LIUX,SHIL,NIUW,LIH,XUGENVIRONMENTALLYFRIENDLYANDHIGHLYSENSITIVERUTHENIUMII5TRIS2,2BIPYRIDYLELECTROCHEMILUMINESCENTSYSTEMUSING2DIBUTYLAMINOETHANOLASCOREACTA
14、NT,ANGEWANDTECHEMIEINTERNATIONALEDITION,2007,46342142416HAKUTAT,SHINZAWAH,OZAKIYPRACTICALMETHODFORTHEDETECTIONOFTETRACYCLINESINHONEYBYHPLCANDDERIVATIVEUVVISSPECTRAANALSCI,2009,259114917VIDALJLMN,AGUILERALUIZMADM,ROMEROGONZALEZR,ETALMULTICLASSANALYSISOFANTIBIOTICRESIDUESINHONEYBYULTRAPERFORMANCELIQUI
15、DCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJAGRFOODCHEM,2009,575176018TSUKAMOTOT,YASUMAM,YAMAMOTOA,ETALEVALUATIONOFSULFOBETAINETYPEPOLYMERRESINASANSPEADSORBENTINTHEANALYSISOFTRACETETRACYCLINEANTIBIOTICSINHONEYJSEPSCI,2009,3221359119LIJ,CHENL,WANGX,ETALDETERMINATIONOFTETRACYCLINESRESIDUESINHONEYBYONLINESOL
16、IDPHASEEXTRACTIONHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTALANTA,2008,755124520FUJITAK,ITOH,ISHIHARAM,ETALANALYSISOFTRACERESIDUESOFTETRACYCLINESINDARKCOLOREDHONEYSBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYUSINGPOLYMERICCARTRIDGEANDMETALCHELATEAFFINITYCHROMATOGRAPHYJFOODHYGSOCJPN,2008,49319621CARRASCOPANCORBOA
17、,CASADOTERRONESS,SEGURACARRETEROA,ETALREVERSEDPHASEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYCOUPLEDTOULTRAVIOLETANDELECTROSPRAYTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYONLINEDETECTIONFORTHESEPARATIONOFEIGHTTETRACYCLINESINHONEYSAMPLESJCHROMATOGRA,2008,11951210722LIUY,XUJZ,DINGT,ETALDETERMINATIONOFTETRACYCLINESINHONEYUS
18、INGLIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHULTRAVIOLETABSORBANCEDETECTIONANDRESIDUECONFIRMATIONBYMASSSPECTROMETRYCHINJCHEM,2007,259129423CASADOTERRONESS,SEGURACARRETEROA,BUSIS,ETALDETERMINATIONOFTETRACYCLINERESIDUESINHONEYBYCZEWITHULTRAVIOLETABSORBANCEDETECTIONELECTROPHORESIS,2007,2816288224PENAA,PELANTOVAN,LINOCM,
19、ETALVALIDATIONOFANANALYTICALMETHODOLOGYFORDETERMINATIONOFOXYTETRACYCLINEANDTETRACYCLINERESIDUESINHONEYBYHPLCWITHFLUORESCENCEDETECTIONJAGRFOODCHEM,2005,5310378425VIASP,BALSALOBREN,LPEZERROZC,ETALLIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHULTRAVIOLETABSORBANCEDETECTIONFORTHEANALYSISOFTETRACYCLINERESIDUESINHONEYJCHROMATO
20、GRA,2004,102212125626NAKAZAWAH,INOS,KATOK,ETALSIMULTANEOUSDETERMINATIONOFRESIDUALTETRACYCLINESINFOODSBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONTANDEMMASSSPECTROMETRYJCHROMATOGRB,1999,73215527KACZMAREKM,LISSCHEMILUMINESCENCEDETERMINATIONOFTETRACYCLINESUSINGFENTONSY
21、STEMINTHEPRESENCEEUROPIUMIIIIONSANALCHIMACTA,2009,639129628KACZMAREKM,IDZIKOWSKAA,LISSEUROPIUMSENSITIZEDCHEMILUMINESCENCEOFSYSTEMTETRACYCLINEH2O2FEII/IIIANDITSAPPLICATIONTOTHEDETERMINATIONOFTETRACYCLINEJFLUORESC,2008,186119329RICHTERMMELECTROCHEMILUMINESCENCEECLCHEMREV,2004,1046300330WEIH,WANGESOLID
22、STATEELECTROCHEMILUMINESCENCEOFTRIS2,2BIPYRIDYLRUTHENIUMTRENDSANALCHEM,2008,2754477文献综述应用化学电化学发光法测定食品中四环素总量摘要本文总结比较了用微生物法、色谱法、酶联免疫吸附法（ELISA）测定食品中四环素含量的优缺点，并对运用电化学发光法测定食品中四环素总量的方法进行了评述。关键字四环素微生物法色谱法酶联免疫吸附法（ELISA）电化学发光法（ECL）一、四环素的分析概况四环素类TETRACYCLINES,TCS抗生素分子式为C22H26N2O7，分子量43045，它们具有十二氢化并四苯基结构，是一种广谱
23、抗菌药物。由于具备抗菌谱广以及价格低廉等优点，已被广泛应用于畜禽、水生动物和蜜蜂养殖中，也被用于预防和治疗多种感染性疾病、促生长、提高饲料转化率等。其结构为R3R2OHOHR1OHNOHCONH2OOCH3H3CR1R2H,R3CH3TETRACYCLINER1O,R2CH3,R3HOXYTRACYCLINER1H,R2CH3,R3HCHLORTETRACYCLINER1OH,R2R3HDOXYCYCLINE图1四环素类抗生素的结构式常用的TCS主要有四环素TETRACYCLINE,TC、金霉素CHLORTETRACYCLINE,CTC、土霉素OXYTETRACYCLINE,OTC、强力霉素D
24、OXYCYCLINE,DC等。人们长期食用含有这类药物的动物产品及其制品，会严重危及人类的身体健康。因此许多国家和组织对TCS残留实施的最大残留值限定MAXIMUMRESIDUELIMITS,MRLS，如欧盟规定8在肝脏中残留的MRLS为03MG/KG，牛奶或者肌肉中的MRLS为01MG/KG，蜂蜜中的MRLS为001MG/KG1，美国食品药管局规定MRLS，在肌肉中为2MG/KG，肝脏中为6MG/KG牛奶中为04MG/KG2，我国规定动物源性食品中四环素抗生素的最大残留量为01MG/KG。近年来，国内外食品分析工作者十分关注四环素类药物残留检测技术，并建立了多种检测方法微生物法35，色谱法6
25、11，酶联免疫吸附法ELISA1213等。11微生物法微生物法是基于对抗生素敏感的实验菌在适当的条件下，其产生的抑菌圈的大小和抗生素的浓度具有线性关系而建立的一种方法。林修光等4研究了用标准纸片法快速测定鸡肉中四环素类残余量，样品经PH为45的磷酸盐缓冲液提取、离心，取其上清液进行检验，若检验液与005MG/KG得标准溶液同样产生10MM以上明显的抑菌圈时，则需要进行加热来确认试验；若没有出现抑菌圈者则判为四环素类抗生素阴性。该方法的灵敏度为005MG/KG。戴栗洁5通过改变制备藤黄微球菌的培养温度，对土霉素的含量进行了测定，在8724161G/ML浓度范围内剂量的对数与抑菌圈的直径具有线性关
26、系，可通过该线性关系制作标准曲线，从而测定土霉素的含量。微生物法虽然原理及操作简单,但是测定所花时间太长、灵敏度低、特异性差、检出限高3MG/KG，目前应用较少。12色谱法121薄层色谱法薄层色谱法包括正相薄层色谱NPTLC和反相薄层色谱RPTLC两种方法。已经有人报道了以纤维素6,7、硅胶8、硅藻土9为吸附剂的薄层色谱方法用于四环素类抗生素的分离，但是由于四环素类药物可以与吸附剂中存在的痕量金属离子形成稳定的络合物，从而使分离效果较差，测定数据不准确。122高效液相色谱法GUSTAVOTAYARPERES等10建立了一种蜂蜜中土霉素OTC、四环素TC和金霉素CTC残留量的HPLCFD检测法。
27、蜂蜜样品使用C18固相萃取柱萃取，60L10G/ML的DC溶液作为内标物，混合物的分离通过使用C18柱完成。流动相A是NA2EDTA2H2O、二水合醋酸钠和二水合氯化钙的混合水溶液，流动相B是95的甲醇溶液，流速为10ML/MIN，荧光检测在390NM的激发波长和512NM的发9射波长下。实验结果得到的线性范围25500G/KG。日内精确度OTC在100G/KG、200G/KG、300G/KG分别为102、98和95，TC分别为102、96和111，CTC分别为101、92和108。日间精密度OTC在100G/KG、200G/KG、300G/KG分别为100、98和98，TC为97、98和10
28、4，CTC为101、98和105。UEONR等11建立了一种食用鱼和小虾中四环素和土霉素的HPLC检测方法。以甲醇草酸为流动相，两者比值为19，用28的氨水调节PH值为70，检测波长为360NM，检测限为002G/G。色谱法灵敏度高，并且准确性好，但样品前处理过程非常复杂、分析测试的价格昂贵、分析速度慢，不适合于现场、快速的检测分析。13酶联免疫吸附法ELISA酶联免疫吸附法ELISA是目前我国测定动物食品中TCS的国标法12。其方法是将试样中残留的四环素类药物经提取和结合在酶标版上的抗原共同竞争抗四环素类药物抗体上有限的结合位点，在通过与酶标羊抗免抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，有色
29、产物的吸光值与试样中金霉素、土霉素、四环素、多西环素浓度成反比。DEWASCH等13采用酶联免疫吸附法分析测定了猪肉和鸡肉中四环素类药物的残留，可检测到四环素类药的最低水平是欧洲的MRL值或更低。应用酶联免疫法检测动物性产品中金霉素、土霉素、四环素、多西环素等四环素类药物的报道很多，这些报道中的检测限均低于20G/KG，回收率在45120。酶联免疫吸附法具有仪器简单、操作方便，灵敏度高，专属性强，适用于大批量样品分析等优点，目前已广泛应用于动物性食品中四环素类药物残留的检测，其存在的缺点是检测结果具有一定的假阳性，且只能测定四环素类药物总残留量，不能进行单独分析。以上方法不可避免都有一定局限性
30、。微生物法虽然原理及操作简单，但是测定所花时间太长、灵敏度低、特异性差，且农牧产品中残留的其他药物极易干扰实验结果。薄层色谱法具有简便、快速、不需要复杂仪器等优点，已广泛应用于四环素混合物的快速定性检测，但该方法分辨率、灵敏度较低，且易于产生干扰。HPLC法是目前报道和应用最多的四环素类药物残留的检测方法，一般可以进行准确的定量测定，具有高效、快速、灵敏度高、检出率高等优点，特别是在对同10类药物残留的检测中精密度好，回收率高，可广泛应用于动物性产品中抗生素残留量的监测和监控，但该方法不能准确定性，尤其是违禁药物的定性检测。ELISA操作方便、仪器简单，但灵敏度较低，且抗干扰能力差。综上所述，
31、建立一种快速，经济，准确的检测四环素类药物的残留方法是非常重要的。目前，TCS的电化学发光ECL检测法因其简单，高灵敏度，宽动态范围而成为一种受人注目的分析技术。电化学发光ECL是一种利用电化学技术与化学发光方法相结合的技术。ECL具有装置简单、重现性好、可进行原位INSITU检测，且还具有高灵敏度和高选择性等特点，目前相关研究已引起人们极大的兴趣，其中RUBPY32/TPA为应用最广泛的ECL检测体系之一。崔华研究组研究发现四环素与土霉素可以抑制RUBPY32/TPA电化学发光，他们建立了一种FIECL测定法，用于测定样品中四环素和土霉素的含量。文献14中报道的这两种四环素类药物的检测限约为
32、12108G/ML。但从文献中可知其方法检测限还未达到欧盟的规定，也不能按照欧盟的标准检测四环素类药物总量的残留。三联吡啶钌电化学发光体系是目前最受注目的TCS测定体系，ECL检测法快速，经济，准确，适用性高。但目前报道的崔华研究组的研究结果也存在一些缺点。因此对该检测法进行改进优化是非常重要的。徐国宝课题组也研究报道了用DBAE代替TPA的三联吡啶钌的电化学发光体系，并在文献中15总结了其优于TPA的特点。许多研究机构也不断在探索更佳的共反应剂。因此，本研究拟采用ECL检测法，将基于TCS能增强RUBPY32的电化学发光的机理来准确测定食品中四环素含量，探索选择最佳的共反应剂，优化各种反应条
33、件，提高精确度。在目前检测TCS的方法中，未见定量限LOQ达到1010G/ML数量级的报道。参考文献1COMMISSIONREGULATIONNO2377/90,OFFJEURCOMMUN18AUGUST1990NOL2242USCODEOFFEDERALREGULATIONS,TITLE21,PART556,SECTIONS150,500,AND720,USGOVERNMENTPRINTINGOFCE,WASHINGTONDC,2003CHAPTER13ANTIBIOTICRESIDUESINMILK,DAIRYPRODUCTSANDANIMALTISSUESMETHODS,REPORTSA
34、NDPROTOCOLSNATIONALCENTREFORANTIBIOTICANDINSULINANALYSIS,FOODANDDRUGADMINISTRATION,DEPARTMENTOFHEALTH,EDUCATIONANDWELFAREWASHINGTON,DC,19684林修光,寇运同,贾臻,等用标准纸片法快速测定鸡肉中四环素族残留量J口11岸卫生控制,2001,6319215戴栗洁土霉素生物检定条件的改进J锦州医学院学报,2001,225346OMEGAFR,HERNANDEZA,AYILAGG,ETALINCREASEDMATRIXMETALLOPROTEINASEACTIVITY
35、ANDREDUCEDTISSUEINHIBITOROFMETALLOPROTEINASESLLEVELSINAMNIOTICFLUIDSFROMPREGNANCIESCOMPLICATEDBYPREMATURERUPTUREOFMEMEBRANESJAMJOBSTETGYNECVL,1996,17413717VALLEEBL,AULDDSZINCCOORDINATION,FUNTIONANDSTRUCTUREOFZINEENYMESANDOTHERPROTEINSJBIOCHEMISTRY,L991,2956478WEINBERGMA,BRALMTETRACYCLINEANDITSANALOG
36、UESATHERAPEUTICPARADIGMINPERIODONTALDISEASEJCRITREVORALBIOLMED,1998,93229MASTIMORIN,TSUKAMOTOT,MIYAON,ETALINHIBITORYEFFECTOFMINOCYCLINEONINVITROINVASIONANDEXPERIMENTALMETASTASISOFMOUSERENALADENOCARCINOMAJJUROL,1994,151140010PERESGT,RATHS,REYESFGRAHPLCWITHFLUORESCENCEDETECTIONMETHODFORTHEDETERMINATIO
37、NOFTETRACYCLINESRESIDUESANDEVALUATIONOFTHEIRSTABILITYINHONEY,FOODCONTROL,2010,21562062511UENOR,SANGRUNGRUANGK,MIYAKAWAMASIMPLIFIEDMETHODFORTHEDETERMINATIONOFSEVERALFISHDRUGSINEDIBLEFISHANDSHRIMPBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYJFOODRESEARCHINTERNATIONAL,1999,32962963312中华人民共和国国家标准GB/T10252020051
38、3DEWASCHK,OKERMANL,CROUBELSS,ETALDETECTIONOFRESIDUESOFTETRACYCLINEANTIBIOTICSINPORKANDCHICKENMEATCORRELATIONBETWEENRESULTSOFSCREENINGANDCONFIRMATORYTESTSJTHEANALYST,1998,1239122737274114PANGYQ,CUIH,ZHENGHS,WANGH,LIULJ,YUXFFLOWINJECTIONANALYSISOFTETRACYCLINESUSINGINHIBITEDRUBPY32/TRIPROPYLAMINEELECTR
39、OCHEMILUMINESCENCESYSTEM,LUMINESCENCE,2005,201815LIUX,SHIL,NIUW,LIH,XUGENVIRONMENTALLYFRIENDLYANDHIGHLYSENSITIVERUTHENIUMIITRIS2,2BIPYRIDYLELECTROCHEMILUMINESCENTSYSTEMUSING2DIBUTYLAMINOETHANOLASCOREACTANT,ANGEWANDTECHEMIEINTERNATIONALEDITION,2007,46342142412（20届）本科毕业设计电化学发光法测定食品中四环素总量THETOTALAMOUNT
40、OFTETRACYCLINESINFOODDETERMINEDBYANELECTROCHEMILUMINESCENCEMETHOD13电化学发光法测定食品中四环素总量【摘要】目的本文建立一个高灵敏度测定食品中四环素总量的电化学发光法，以蜂蜜作为样品进行测定。方法基于四环素、土霉素、金霉素、强力霉素对三联吡啶钌的电化学发光具有几乎完全相同的增强效应，建立本方法，并阐明其机理。结果在最优的实验条件下，体系中三联吡啶钌的电化学发光强度的增加值与四环素、土霉素、金霉素和强力霉素浓度的对数值具有线性关系，线性范围为101012501010MOLL1，检测限为31013MOLL1。结果精确度和准确度好。机
41、理研究表明，是四环素的电化学氧化产物增强了三联吡啶钌的电化学发光强度。结论该方法简单，灵敏度高，实验结果可靠，可用于食品中四环素总量的测定。【关键词】四环素；三联吡啶钌；电化学发光；蜂蜜；总量。14THETOTALAMOUNTOFTETRACYCLINESINFOODDETERMINEDBYANELECTROCHEMILUMINESCENCEMETHODABSTRACT【ABSTRACT】OBJECTIVETOESTABLISHANELECTROCHEMILUMINESCENCEMETHODWITHHIGHSENSITIVITYTODETERMINETHETOTALAMOUNTOFTETRAC
42、YCLINESINFOODTHEHONEYWASDETERMINEDASSAMPLEMETHODTHEECLOFRUBPY32COULDBEENHANCEDBYTETRACYCLINETC,OXYTETRACYCLINEOTC,CHLORTETRACYCLINECTCANDDOXYCYCLINEDCIDENTICALLYBASEONIT,THISMETHODWASDEVELOPEDANDTHEENHANCEMENTMECHANISMWASSTUDIEDRESULTSUNDERTHEOPTIMIZEDCONDITIONS,THEENHANCEDECLINTENSITYOFTHESYSTEMVER
43、SUSTHELOGARITHMOFTHECONCENTRATIONOFTCSISLINEAROVERACONCENTRATIONRANGE101012501010MOLL1,ANDTHEDETECTIONLIMITIS31013MOLL1THEPRECISIONANDACCURACYAREGOODTHEMECHANISTICSTUDIESDEMONSTRATETHATTHEELECTROOXIDATIONPRODUCTIONOFTCSENHANCETHEECLINTENSITYOFRUBPY32CONCLUSIONTHEPROPOSEDMETHODISSIMPLE,WITHHIGHSENSIT
44、IVITYANDTHERESULTSARERELIABLE,THENCOULDBEUSEDFORTHEDETERMINATIONOFTHETOTALAMOUNTOFTCSINFOOD【KEYWORDS】TETRACYCLINESRUBPY32ELECTROCHEMILUMINESCENCEHONEYTOTALAMOUNT15目录1引言12实验部分421药品与试剂422仪器423ECL测定方法524工作溶液的配制和贮备525缓冲溶液的配制526蜂蜜样品的配制53结果与讨论631实验条件优化632三联吡啶钌电化学发光体系的ECL行为733线性和灵敏度734干扰研究1035方法应用1036机理研究1
45、24结论13参考文献14附录错误未定义书签。11引言四环素类（TETRACYCLINES,TCS）抗生素分子式为C22H26N2O7，分子量43045，它具有十二氢化并四苯基结构，是一种广谱抗菌药物。由于具备抗菌谱广以及价格低廉等优点，已被广泛应用于畜禽、水生动物和蜜蜂养殖中，也被用于预防和治疗多种感染性疾病、促生长、提高饲料转化率等。其结构为R3R2OHOHR1OHNOHCONH2OOCH3H3CR1R2H,R3CH3TETRACYCLINER1O,R2CH3,R3HOXYTRACYCLINER1H,R2CH3,R3HCHLORTETRACYCLINER1OH,R2R3HDOXYCYCLIN
46、E图1四环素类抗生素的结构式常用的TCS主要有四环素（TETRACYCLINE,TC）、金霉素（CHLORTETRACYCLINE,CTC）、土霉素（OXYTETRACYCLINE,OTC）、强力霉素（DOXYCYCLINE,DC）等。临床上主要用于治疗革兰氏阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体等致病原引起的感染。近年来用四环素治疗不少非感染性疾病，取得了很好的疗效。此外，在包括美国在内的一些国家和地区，四环素还被大量用作生长促进剂，投喂给动物，故其在药品市场中占有举足轻重的地位。但是由于不合理使用以及不遵守休药期等因素，造成了该类药物及其降解产物残留于动物组织及畜产品中，人们长期食
47、用含有这类药物的动物产品及其制品，四环素会在人体内慢慢蓄积，当药物浓度达到一定量时，可以对人体产生多种急慢性中毒，导致人体多种器官的病变，会严重危及人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝、肾的损害以及对牙齿和骨骼的破坏，最显著的残留毒性是诱导耐药菌株的产生。因此许多国家和组织对TCS残留实施最大残留值限定（MAXIMUMRESIDUELIMITS,MRLS），如欧盟规定在肝脏中残留的MRLS为03MG/KG，牛奶或者肌肉中的MRLS为01MG/KG，蜂蜜中的MRLS为001MG/KG1，美国食品药管局规定MRLS，在肌肉中为2MG/KG，肝脏中为6MG/KG牛奶中为04M
48、G/KG2，我国规定动物源性食品中四环素抗生素的最大残留量为01MG/KG。近年来，国内外食品分2析工作者十分关注四环素类药物残留检测技术，并建立了多种检测方法微生物法35，色谱法611，酶联免疫吸附法（ELISA）1213等。在众多对四环素的分析测定方法中，微生物法是基于对抗生素敏感的实验菌在适当的条件下，其产生的抑菌圈的大小和抗生素的浓度具有线性关系而建立的一种方法。戴栗洁5通过改变制备藤黄微球菌的培养温度，对土霉素的含量进行了测定，在8724161G/ML浓度范围内的剂量的对数与抑菌圈的直径具有线性关系。可通过该线性关系制作标准曲线，从而测定土霉素的含量。虽然微生物法原理及操作简单，但是
49、测定所花时间太长、灵敏度低、特异性差，且农牧产品中残留的其他药物极易干扰实验结果。薄层色谱法包括正相薄层色谱（NPTLC）和反相薄层色谱（RPTLC）两种方法。已经有人报道了以纤维素6,7、硅胶8、硅藻土9为吸附剂的薄层色谱方法用于四环素类抗生素的分离。该法具有简便、快速、不需要复杂仪器等优点，已广泛应用于四环素混合物的快速定性检测，但是由于四环素类药物可以与吸附剂中存在的痕量金属离子形成稳定的络合物，从而使分离效果较差，测定数据不准确，灵敏度低。高效液相色谱法（HPLC）是目前报道和应用最多的四环素类药物残留的检测方法，一般可以进行准确的定量测定，具有高效、快速、灵敏度高、检出率高等优点，特别是在对同类药物残留的检测中精密度好，回收率高，可广泛应用于动物性产品中抗生素残留量的监测和监控。GUSTAVOTAYARPERES等10建立了一种蜂蜜中土霉素（OTC）、四环素（TC）和金霉素（CTC）残留量的HPLCFD检测法。蜂蜜样品使用C18固相萃取柱萃取，60L10G/ML的DC溶液作为内标物，混合物的分离通过使用C18柱完成。流动相A是NA2EDTA2H2O、二水合醋酸钠和二水合氯化钙的混合水溶液，流动相B是95的甲醇溶液，流速为10ML/MIN，荧光检测在390NM的激发波长和51
