1、（20届）本科毕业设计电化学发光法测定食品中四环素总量THETOTALAMOUNTOFTETRACYCLINESINFOODDETERMINEDBYANELECTROCHEMILUMINESCENCEMETHOD所在学院专业班级应用化学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I电化学发光法测定食品中四环素总量【摘要】目的本文建立一个高灵敏度测定食品中四环素总量的电化学发光法，以蜂蜜作为样品进行测定。方法基于四环素、土霉素、金霉素、强力霉素对三联吡啶钌的电化学发光具有几乎完全相同的增强效应，建立本方法，并阐明其机理。结果在最优的实验条件下，体系中三联吡啶钌的电化学发光强度的增加值与四环素、土霉素、金
2、霉素和强力霉素浓度的对数值具有线性关系，线性范围为101012501010MOLL1，检测限为31013MOLL1。结果精确度和准确度好。机理研究表明，是四环素的电化学氧化产物增强了三联吡啶钌的电化学发光强度。结论该方法简单，灵敏度高，实验结果可靠，可用于食品中四环素总量的测定。【关键词】四环素；三联吡啶钌；电化学发光；蜂蜜；总量。IITHETOTALAMOUNTOFTETRACYCLINESINFOODDETERMINEDBYANELECTROCHEMILUMINESCENCEMETHODABSTRACT【ABSTRACT】OBJECTIVETOESTABLISHANELECTROCHEMI
3、LUMINESCENCEMETHODWITHHIGHSENSITIVITYTODETERMINETHETOTALAMOUNTOFTETRACYCLINESINFOODTHEHONEYWASDETERMINEDASSAMPLEMETHODTHEECLOFRUBPY32COULDBEENHANCEDBYTETRACYCLINETC,OXYTETRACYCLINEOTC,CHLORTETRACYCLINECTCANDDOXYCYCLINEDCIDENTICALLYBASEONIT,THISMETHODWASDEVELOPEDANDTHEENHANCEMENTMECHANISMWASSTUDIEDRE
4、SULTSUNDERTHEOPTIMIZEDCONDITIONS,THEENHANCEDECLINTENSITYOFTHESYSTEMVERSUSTHELOGARITHMOFTHECONCENTRATIONOFTCSISLINEAROVERACONCENTRATIONRANGE101012501010MOLL1,ANDTHEDETECTIONLIMITIS31013MOLL1THEPRECISIONANDACCURACYAREGOODTHEMECHANISTICSTUDIESDEMONSTRATETHATTHEELECTROOXIDATIONPRODUCTIONOFTCSENHANCETHEE
5、CLINTENSITYOFRUBPY32CONCLUSIONTHEPROPOSEDMETHODISSIMPLE,WITHHIGHSENSITIVITYANDTHERESULTSARERELIABLE,THENCOULDBEUSEDFORTHEDETERMINATIONOFTHETOTALAMOUNTOFTCSINFOOD【KEYWORDS】TETRACYCLINESRUBPY32ELECTROCHEMILUMINESCENCEHONEYTOTALAMOUNTIII目录1引言12实验部分421药品与试剂422仪器423ECL测定方法524工作溶液的配制和贮备525缓冲溶液的配制526蜂蜜样品的配
6、制53结果与讨论631实验条件优化632三联吡啶钌电化学发光体系的ECL行为733线性和灵敏度734干扰研究1035方法应用1036机理研究124结论13参考文献14附录错误未定义书签。11引言四环素类（TETRACYCLINES,TCS）抗生素分子式为C22H26N2O7，分子量43045，它具有十二氢化并四苯基结构，是一种广谱抗菌药物。由于具备抗菌谱广以及价格低廉等优点，已被广泛应用于畜禽、水生动物和蜜蜂养殖中，也被用于预防和治疗多种感染性疾病、促生长、提高饲料转化率等。其结构为R3R2OHOHR1OHNOHCONH2OOCH3H3CR1R2H,R3CH3TETRACYCLINER1O,R
7、2CH3,R3HOXYTRACYCLINER1H,R2CH3,R3HCHLORTETRACYCLINER1OH,R2R3HDOXYCYCLINE图1四环素类抗生素的结构式常用的TCS主要有四环素（TETRACYCLINE,TC）、金霉素（CHLORTETRACYCLINE,CTC）、土霉素（OXYTETRACYCLINE,OTC）、强力霉素（DOXYCYCLINE,DC）等。临床上主要用于治疗革兰氏阳性和阴性菌、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体等致病原引起的感染。近年来用四环素治疗不少非感染性疾病，取得了很好的疗效。此外，在包括美国在内的一些国家和地区，四环素还被大量用作生长促进剂，投喂给动物
8、，故其在药品市场中占有举足轻重的地位。但是由于不合理使用以及不遵守休药期等因素，造成了该类药物及其降解产物残留于动物组织及畜产品中，人们长期食用含有这类药物的动物产品及其制品，四环素会在人体内慢慢蓄积，当药物浓度达到一定量时，可以对人体产生多种急慢性中毒，导致人体多种器官的病变，会严重危及人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝、肾的损害以及对牙齿和骨骼的破坏，最显著的残留毒性是诱导耐药菌株的产生。因此许多国家和组织对TCS残留实施最大残留值限定（MAXIMUMRESIDUELIMITS,MRLS），如欧盟规定在肝脏中残留的MRLS为03MG/KG，牛奶或者肌肉中的MRLS
9、为01MG/KG，蜂蜜中的MRLS为001MG/KG1，美国食品药管局规定MRLS，在肌肉中为2MG/KG，肝脏中为6MG/KG牛奶中为204MG/KG2，我国规定动物源性食品中四环素抗生素的最大残留量为01MG/KG。近年来，国内外食品分析工作者十分关注四环素类药物残留检测技术，并建立了多种检测方法微生物法35，色谱法611，酶联免疫吸附法（ELISA）1213等。在众多对四环素的分析测定方法中，微生物法是基于对抗生素敏感的实验菌在适当的条件下，其产生的抑菌圈的大小和抗生素的浓度具有线性关系而建立的一种方法。戴栗洁5通过改变制备藤黄微球菌的培养温度，对土霉素的含量进行了测定，在8724161
10、G/ML浓度范围内的剂量的对数与抑菌圈的直径具有线性关系。可通过该线性关系制作标准曲线，从而测定土霉素的含量。虽然微生物法原理及操作简单，但是测定所花时间太长、灵敏度低、特异性差，且农牧产品中残留的其他药物极易干扰实验结果。薄层色谱法包括正相薄层色谱（NPTLC）和反相薄层色谱（RPTLC）两种方法。已经有人报道了以纤维素6,7、硅胶8、硅藻土9为吸附剂的薄层色谱方法用于四环素类抗生素的分离。该法具有简便、快速、不需要复杂仪器等优点，已广泛应用于四环素混合物的快速定性检测，但是由于四环素类药物可以与吸附剂中存在的痕量金属离子形成稳定的络合物，从而使分离效果较差，测定数据不准确，灵敏度低。高效液
11、相色谱法（HPLC）是目前报道和应用最多的四环素类药物残留的检测方法，一般可以进行准确的定量测定，具有高效、快速、灵敏度高、检出率高等优点，特别是在对同类药物残留的检测中精密度好，回收率高，可广泛应用于动物性产品中抗生素残留量的监测和监控。GUSTAVOTAYARPERES等10建立了一种蜂蜜中土霉素（OTC）、四环素（TC）和金霉素（CTC）残留量的HPLCFD检测法。蜂蜜样品使用C18固相萃取柱萃取，60L10G/ML的DC溶液作为内标物，混合物的分离通过使用C18柱完成。流动相A是NA2EDTA2H2O、二水合醋酸钠和二水合氯化钙的混合水溶液，流动相B是95的甲醇溶液，流速为10ML/M
12、IN，荧光检测在390NM的激发波长和512NM的发射波长下。实验结果得到的线性范围25500G/KG。日内精确度OTC在100G/KG、200G/KG、300G/KG分别为102，98和95，TC分别为102、96和111，CTC分别为101、92和108。日间精密度OTC在100G/KG、200G/KG、300G/KG分别为100、98和98，TC为97、98和104，CTC为101、98和105。UEONR等11建立了一种食用鱼和小虾中四环素和土霉素的HPLC检测方法。以甲醇和草酸为流动相，两者比值为19，用28的氨水调节PH值等于70，检测波长为360NM，检测限为002G/G。但该方
13、法不能准确定性，尤其是违禁药物的定性检测。酶联免疫吸附法（ELISA）具有仪器简单、操作方便，灵敏度高，专属性强，适用于大批量样品分析等优点，目前已广泛应用于动物性食品中四环素类药物残留的检测，也是目前我国测定动物食品中TCS的国标法12。其方法是将试样中残留的四环素类药3物经提取和结合在酶标版上的抗原共同竞争抗四环素类药物抗体上有限的结合位点，在通过与酶标羊抗免抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，有色产物的吸光值与试样中金霉素、土霉素、四环素、强力霉素的浓度成反比。DEWASCH等13采用酶联免疫吸附法分析测定了猪肉和鸡肉中四环素类药物的残留，该方法可检测到四环素类药物的最低水平是欧洲的
14、MRL值或者更低。应用酶联免疫法检测动物性产品中金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等四环素类药物的报道很多，这些报道中的检测限均低于20G/KG，回收率在45120。但其存在的缺点是检测结果具有一定的假阳性，且只能测定四环素类药物总残留量，不能进行单独分析。因此建立一种快速，经济，准确的检测四环素类药物的残留方法是非常重要的。目前，电化学发光（ELECTROCHEMILUMINESCENCE，简称ECL）法来越受到关注。ECL与一般的化学发光（CL）不同，它是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程，是一种利用电化学技术与化学发光方法相结合的技术。EC
15、L与CL的差异在于CL是通过化合物混合启动发光反应，ECL是电启动发光反应，在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分发生化学反应而产生的一种光辐射。早在1927年，就已经有人发现了光的发射，但是之后的三十多年来，关于电化学发光的文章报道的还不到10篇，直到60年代中期，随着电子科技的不断发展，高灵敏度的光电传感器诞生，化学发光技术也在同时得到很大的发展，化学发光领域中发现了许多可以导致化学发光的物质。再经过40年的研究后，电化学发光已经成为一项重要的分析技术，并被广泛的用于食品和水样测定，免疫测定以及生物试剂测试等领域。ECL的原理是利用电极原位产生试剂，这些试剂在
16、溶液中反应，完成较高能量的电子转移而生成激发态的分子，不稳定的激发态分子回到基态过程中以光辐射形式释放能量。电化学发光由于结合化学发光方法和电化学方法的优点，一方面可以从光学和电化学两个侧面对一些体系进行更全面的研究，这样可以更加有利于揭示许多单独用一种方法难以深入了解的问题；另一方面，电化学发光分析方法的灵敏度常常只取决于电极表面附近分析物的浓度，极大地方便了分离与富集。此外，ECL还具有装置简单、重现性好、可进行原位INSITU检测和高选择性等特点，其相关研究已引起人们极大的兴趣，其中RUBPY32/TPA为应用最广泛的ECL检测体系之一。崔华研究组14研究发现四环素与土霉素可以抑制RUB
17、PY32/TPA电化学发光，建立了一种FIECL分析法来测定样品中的四环素残留。结果表明，该方法灵敏，简单，快速，准确，具有很宽的动态范围，比大多数常规的光谱法，HPLC和电化学分析法更好，能应用于实际样品中TC的测定。但从文献中也可知该方法灵敏度略显不足，且只能单独测定TC或OTC，不能测定总量。4本研究中，基于TC、OTC、CTC、DC对三联吡啶钌RUBPY32的ECL具有相同的增强效应，建立本方法。目前已报道的ECL发光体系有鲁米诺体系、三联吡啶钌体系、多环芳烃体系和光泽精体系。三联吡啶钌电化学发光体系是目前最受注目的测定TCS的体系，该体系可以在水溶液中室温下进行，无需除氧和其他杂质，
18、且发光量子产率高，具有高灵敏度，宽动态范围，稳定性，简单性和多功能性的特点。RUBPY32是第一个被发现具有ECL性质的无机化合物，已经被证明是最具有理论研究和商业应用价值的ECL物质。从1972年关于RUBPY32的第一篇报道之后，相继又出现了很多关于RUBPY32研究报道。由于电化学发光（ECL）是由RUBPY32和共反应剂间的电化学反应产生的，大量的研究已经集中于探索用于RUBPY32测定的有效的共反应剂。徐国宝课题组15已研究发现二丁基乙醇胺（DBAE）作为共反应剂显示出比使用已久的共反应剂三丙胺（TPA）更大的优势。许多的研究机构也在不断地探索更适用于三联吡啶钌电化学发光体系的共反应
19、剂。在实验中，我们也不断地对该反应的各项条件进行优化，从而建立了该方法，其灵敏度为现有方法中最高，且可用于测定总量。作为应用，可用于测定食品中四环素的总量。2实验部分21药品与试剂四环素类药物（TCS）购自FLUKA；三联吡啶钌（RUBPY3CL26H2O）购自SIGMA；蜂蜜样品购自市场；水为超纯水（HEALFORCEPW超纯水机，香港，18MCM）；其它各种试剂均为分析纯。22仪器ECL测量采用自建系统，由BPCL1TIC型微弱化学与生物发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）和CHI660A电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）组成。三电极系统直径为3MM的玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，
20、饱和甘汞电极为参比电极。5ML自制石英杯为池。523ECL测定方法在ECL池中加RUBPY32溶液10L和缓冲液（PH8）990L，再加入样品或标准溶液，同时记录ECL强度电位曲线（IECLE）、循环伏安曲线（CV）。电位范围0816V，扫速005VS1。TCS含量根据ECL增强值I确定，IISI0，其中I0为不存在TCS时RUBPY32的ECL强度，IS为存在TCS时RUBPY32的ECL强度。温度251C。24工作溶液的配制和贮备称取RUBPY3CL26H2O适量，溶解在蒸馏水中，定容于棕色容量瓶，配成浓度为10103MOLL1的标准贮备溶液，20C避光保存。取贮备溶液加适量水配制成工作溶
21、液，临用前现配。取适量盐酸四环素配制成浓度为4000102G/ML的盐酸四环素标准溶液，并采用逐级稀释法得到一系列的标准溶液储存与冰箱中，待用。25缓冲溶液的配制配制BRITTONROBINSON缓冲溶液（BR），用磷酸、硼酸和醋酸配制250ML的BR缓冲溶液置于250ML的容量瓶中，使得磷酸、硼酸和醋酸的浓度均为004MOL/L，放置冰箱中，待用。使用时，用02MOL/L的NAOH溶液在酸度计上调至所需PH值。配制磷酸盐缓冲溶液（PBS），在800ML蒸馏水中溶解8GNACL、02GKCL、144GNA2HPO4和024GKH2PO4，用HCL调节溶液的PH值至74加水定容至1L，在15LB
22、F/IN21034105PA高压下蒸气灭菌20MIN。放置在冰箱中，待用。配制NAHCO3NA2CO3缓冲溶液，根据所需的PH值决定NAHCO3和NA2CO3的量，两者混合，配制成一系列不同PH值的NAHCO3NA2CO3缓冲溶液放置在冰箱中，待用。配制TRIS缓冲液，某一特定PH值的005MOL/LTRIS缓冲液的配制将50ML01MOL/LTRIS碱溶液与相应体积的01ML/LHCL混合，加水将体积调至100ML。将配制好的不同PH值的TRIS缓冲液放置在冰箱中，待用。26蜂蜜样品的配制取市售蜂蜜样品00607G置于样品管中，加入2ML的蒸馏水中溶解，震荡至样品完全6溶解，待用。3结果与讨
23、论31实验条件优化ECL的增强值I与缓冲液的种类及其PH值，电位的施加方式和扫速以及三联吡啶钌的浓度等均有很大的关系。因此，本实验对以上因素进行了优化。311缓冲溶液及其PH值优化比较了BR缓冲液、PBS缓冲液、NAHCO3NA2CO3缓冲液和TRIS缓冲液作为三联吡啶钌电化学发光体系的缓冲溶液时ECL的行为。结果表明缓冲介质为TRIS缓冲溶液时获得的I最大。故选用TRIS缓冲溶液作为体系的缓冲介质。同时I受缓冲溶液PH影响较大，研究了TRIS缓冲液PH在60100范围内该体系的ECL。当PH80时，I随PH值升高而减小，故PH80作为最佳PH。因此，PH80的TRIS缓冲液为最优缓冲溶液。3
24、12电压施加方式及扫速优化比较了CV、双电位阶跃法、差分脉冲法等电位施加模式对三联吡啶钌电化学发光体系ECL行为的影响，扫描速度为015V。结果表明电化学行为为CV时，猝灭效果明显、稳定且信噪比较高。同时研究了CV扫描速率对I的影响，扫描在001V/S到005V/S时，I随扫描速率的增大而明显的增加，当扫描速率超过005V/S时，I达到最大值并基本保持不变，故选择005V/S作为最佳扫描速率。因此，采用扫速为005VS1的CV加压方式为最优方式。313三联吡啶钌浓度的优化基于上述条件的优化，进一步对三联吡啶钌的浓度进行了优化。结果表明当RUBPY32浓度在1010610105MOL/L范围时，
25、I随RUBPY32浓度增大而增加，当RUBPY32浓度高于10105MOL/L时，I随RUBPY32浓度的增大缓慢增加，故选用10105MOL/L作为RUBPY32的最优浓度。732三联吡啶钌电化学发光体系的ECL行为如图1所示，TC（图1A）、OTC（图1B）、CTC（图1C）、DC（图1D）均没有ECL行为，与RUBPY32溶液（图1E）相比，RUBPY32TC（图1F）、RUBPY32OTC（图1G）、RUBPY32CTC（图1H）、RUBPY32DC（图1I）混合溶液的ECL强度均明显增强，且图1F、1G、1H、1I的IECLE曲线近似重叠，表明TC、OTC、CTC、DC对RUBPY3
26、2的增强效应几乎是完全一致，由此表明本方法不仅可以单独测量，也可以测定TCS总量。图1一系列IECLE曲线FIG1IECLECURVESOFTCA,OTCB,CTCC,DCD,RUBPY32E,RUBPY32TCF,RUBPY32OTCG,RUBPY32CTCH,RUBPY32DCITCS501011MOLL1,RUBPY3210105MOLL133线性和灵敏度在最优条件下，平行测定一系列不同浓度的TC10105MOLL1RUBPY32混合溶液在不同电压下的ECL行为，所得IECLE曲线如图2A所示。由图可知，ECL强度随TC的浓度增大而增大。以I为纵坐标，TC浓度的对数为横坐标作图，得图2B
27、，可知在101012TCOTCCTCDC8501010MOLL1范围内，I与TC浓度的对数成正比，其线性回归方程为I12083LGC163505R09948按S/N3计算，检测限约为31013MOLL1。图2一系列IECLE曲线A和ILGC校准曲线BFIG2IECLECURVESOF10105MOLL1RUBPY32WITHDIFFERENTCONCENTRATIONOFTCA,ANDCALIBRATIONCURVESBETWEENIANDLGCTCBAG0,101012MOLL1,501012MOLL1,101011MOLL1,501011MOLL1,101010MOLL1,501010MO
28、LL1因考虑到实际样品在检测过程中稀释了100倍，故对实际样品的检测限为31011MOLL1，约相当于121011GML1，完全可以满足MRLS水平的检测。将其与现有方法相比较，如表1所示，本方法的灵敏度极高，比现有方法中灵敏度最高HPLCMSMS高约数10倍。9表1现有方法的灵敏度比较TAB1COMPARISONOFTHESENSITIVITYOFMAINMETHODSREPORTEDANALYTICALMETHODLODORLOQREFERENCESTHISMETHOD201011GML1LODHPLCMSMS320GL1LOD12NGG1LOD4GKG1LOQ00010004PPMLOD
29、18221726HPLCFD8GKG1LOD00150024MGKG1LOQ49GKG1LOD102024HPLCUV002004GKG1LOQ512NGG1LOD002103GKG1LOD1530NGG1LOD16192125CE239493GKG1LOD23CL14107MOLL1LOD5108MOLL1LOD2728FIECL40109GML1LOD14为了验证本法同样可以测定四种TCS的总量，我们对不同比例的四种TCS的混合溶液进行了检测，其中包括浓度比例为1111的TCOTCCTCDC与任意比例MNPQ的TCOTCCTCDC。表2中列出了TC、OTC、CTC、DC、TCOTCCTCD
30、C1111、TCOTCCTCDCMNPQ，任意比例六种溶液对RUBPY32ECL增强的线性范围、相关系数、检测限。由于四种TCS具有类似的结构，所以检测出的四种TCS线性方程的斜率与截距非常接近。此实验结果表明，四种TCS的混合溶液同样可以增强该体系的ECL。四种混合TCS的增强行为与单个TCS的增强行为相似，由此再次表明本方法可用于测定TCS总量。10表2线性和灵敏度TAB2LINEARITYANDSENSITIVITYCOMPOUNDSREGRESSIONEQUATIONSLINEARRANGE/MOLL1RLOD/MOLL1TCI12083LGC163505101012501010099
31、4831013OTCI12654LGC1657561010125010100992131013CTCI12278LGC1614271010125010100998931013DCI12356LGC1642151010125010100994231013TCOTCCTCDC1111I12477LGC1649021010125010100997931013TCOTCCTCDCMNPQAI12303LGC1635201010125010100999031013AMNPQIS32010234干扰研究为了研究该方法的在食品分析中实际应用，需要测定各种外来物质的干扰，当TCS浓度为4109G/ML时，相对
32、误差要小于5。蜂蜜是一种成分极为复杂的糖类复合体，含有大量的糖类、酸类、矿物质、酶类、维生素、蛋白质、氨基酸、添加剂等，故本研究对上述可能的共存物质进行了干扰实验。1000000倍NA、K、NO3、CL；10000倍ZN2、NH4、CO32、SO42、PO43、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、山梨糖、淀粉；5000倍的MG2、亮氨酸、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、冬氨酸；2500倍CA2、苯基丙氨酸、谷氨酸盐、蛋氨酸、胱氨酸、麦芽糖、琼脂糖；1000倍的CU2、FE3、羟脯氨酸、络氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸；1500倍的双甲脒、杀虫脒、甲硝唑；1250倍链霉素；500倍沙星类、青霉头
33、孢类；100倍磺胺类、硝基呋喃类；50倍大环内酯类；25倍有机磷类；20倍咪唑达唑类对TCS检测没有明显干扰。35方法应用为了验证本方法的准确性，应用本法测定蜂蜜样品中TC的残留量。取已配制成溶液的11市售蜂蜜样品，加标，平行测定5次，计算相对标准偏差和回收率，如表3所示。该方法的相对标准偏差（RSD）在4392，回收率在9161083。此结果表明本法精密度和准确度良好，用于实际样品中TCS的测定是可行的。因此本研究提出的电化学发光法检测蜂蜜中TCS残留具有很好的应用前景。表3精密度和回收率TAB3PRECISIONANDACCURACYCODECOMPOUNDSCTCS109GML1RSDR
34、ECOVERYADDEDFOUNDA1TC0100093400056609342OTC05004670043929343CTC100108300797310834DC5004580237529165TCOTCCTCDC1111100104600777410466TCOTCCTCDCMNPQB500483020943966AMEANSD,N5BMNPQIS3201021236机理研究为了探究RUBPY32溶液和TCS间是否发生化学反应产生新物质，测定了该反应体系的紫外可见光谱图。研究显示RUBPY32溶液和四环素混合溶液的紫外可见光谱是RUBPY32溶液和四环素溶液的紫外可见光谱的简单叠加。这表
35、明两者相互混合并不会发生化学反应，产生新物质。又由图3所示的CV图可知在02V/S的扫速下，四环素的电化学氧化产物与三联吡啶钌之间具有相互作用。图3一系列循环伏安图（扫速02VS1）FIG3ASERIESCYCLICVOLTAMMOGRAMS（SCANRATE02VS1）ABLANKB50104MOLL1RUBPY32C10104MOLL1TCD50104MOLL1RUBPY3210104MOLL1TC根据参考文献14,29,30，可推测本方法的机理可能如图4所示，具体反应途径为TCS在电极表面脱氢失电子，生成活性自由基TC，TC催化了RUBPY32的氧化产物RUBPY33转化为激发态RUBP
36、Y32的过程，使RUBPY32返回基态时释放光子的速度大大加快，故电化学发光大大增强。134结论因为四环素、土霉素、金霉素、强力霉素具有非常相似的分子结构，四者对三联吡啶钌的电化学发光的增强效应几乎完全相同。基于该原理，本研究建立了一个测定四环素的电化学发光法，可简单、灵敏、准确地测定四环素的总量，并对该发光体系的反应机理进行了深入的研究探讨。该方法比大多数常规的四环素分析法微生物法、色谱法、酶联免疫分析法等更好，灵敏度更高，比现有方法中灵敏度最高的HPLCMSMS高约数10倍，并且能应用于实际样品的测定，完全可以满足MRLS水平的检测。14参考文献1COMMISSIONREGULATIONN
37、O2377/90,OFFJEURCOMMUN18AUGUST1990NOL2242USCODEOFFEDERALREGULATIONS,TITLE21,PART556,SECTIONS150,500,AND720,USGOVERNMENTPRINTINGOFCE,WASHINGTONDC,2003CHAPTER13ANTIBIOTICRESIDUESINMILK,DAIRYPRODUCTSANDANIMALTISSUESMETHODS,REPORTSANDPROTOCOLSNATIONALCENTREFORANTIBIOTICANDINSULINANALYSIS,FOODANDDRUGADMI
38、NISTRATION,DEPARTMENTOFHEALTH,EDUCATIONANDWELFAREWASHINGTON,DC,19684林修光,寇运同,贾臻,等用标准纸片法快速测定鸡肉中四环素族残留量J口岸卫生控制,2001,6319215戴栗洁土霉素生物检定条件的改进J锦州医学院学报,2001,225346OMEGAFR,HERNANDEZA,AYILAGG,ETALINCREASEDMATRIXMETALLOPROTEINASEACTIVITYANDREDUCEDTISSUEINHIBITOROFMETALLOPROTEINASESLLEVELSINAMNIOTICFLUIDSFROMPR
39、EGNANCIESCOMPLICATEDBYPREMATURERUPTUREOFMEMEBRANESJAMJOBSTETGYNECVL,1996,17413717VALLEEBL,AULDDSZINCCOORDINATION,FUNTIONANDSTRUCTUREOFZINEENYMESANDOTHERPROTEINSJBIOCHEMISTRY,L991,2956478WEINBERGMA,BRALMTETRACYCLINEANDITSANALOGUESATHERAPEUTICPARADIGMINPERIODONTALDISEASEJCRITREVORALBIOLMED,1998,93229M
40、ASTIMORIN,TSUKAMOTOT,MIYAON,ETALINHIBITORYEFFECTOFMINOCYCLINEONINVITROINVASIONANDEXPERIMENTALMETASTASISOFMOUSERENALADENOCARCINOMAJJUROL,1994,151140010PERESGT,RATHS,REYESFGRAHPLCWITHFLUORESCENCEDETECTIONMETHODFORTHEDETERMINATIONOFTETRACYCLINESRESIDUESANDEVALUATIONOFTHEIRSTABILITYINHONEY,FOODCONTROL,2
41、010,21562062511UENOR,SANGRUNGRUANGK,MIYAKAWAMASIMPLIFIEDMETHODFORTHEDETERMINATIONOFSEVERALFISHDRUGSINEDIBLEFISHANDSHRIMPBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYJFOODRESEARCHINTERNATIONAL,1999,32962963312中华人民共和国国家标准GB/T102520200513DEWASCHK,OKERMANL,CROUBELSS,ETALDETECTIONOFRESIDUESOFTETRACYCLINEANTIBIOT
42、ICSINPORKANDCHICKENMEATCORRELATIONBETWEENRESULTSOFSCREENINGANDCONFIRMATORYTESTSJTHEANALYST,1998,1239122737274114PANGYQ,CUIH,ZHENGHS,WANGH,LIULJ,YUXFFLOWINJECTIONANALYSISOFTETRACYCLINES15USINGINHIBITEDRUBPY32/TRIPROPYLAMINEELECTROCHEMILUMINESCENCESYSTEM,LUMINESCENCE,2005,20181515LIUX,SHIL,NIUW,LIH,XU
43、GENVIRONMENTALLYFRIENDLYANDHIGHLYSENSITIVERUTHENIUMIITRIS2,2BIPYRIDYLELECTROCHEMILUMINESCENTSYSTEMUSING2DIBUTYLAMINOETHANOLASCOREACTANT,ANGEWANDTECHEMIEINTERNATIONALEDITION,2007,46342142416HAKUTAT,SHINZAWAH,OZAKIYPRACTICALMETHODFORTHEDETECTIONOFTETRACYCLINESINHONEYBYHPLCANDDERIVATIVEUVVISSPECTRAANAL
44、SCI,2009,259114917VIDALJLMN,AGUILERALUIZMADM,ROMEROGONZALEZR,ETALMULTICLASSANALYSISOFANTIBIOTICRESIDUESINHONEYBYULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJAGRFOODCHEM,2009,575176018TSUKAMOTOT,YASUMAM,YAMAMOTOA,ETALEVALUATIONOFSULFOBETAINETYPEPOLYMERRESINASANSPEADSORBENTINTHEANALYSISO
45、FTRACETETRACYCLINEANTIBIOTICSINHONEYJSEPSCI,2009,3221359119LIJ,CHENL,WANGX,ETALDETERMINATIONOFTETRACYCLINESRESIDUESINHONEYBYONLINESOLIDPHASEEXTRACTIONHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYTALANTA,2008,755124520FUJITAK,ITOH,ISHIHARAM,ETALANALYSISOFTRACERESIDUESOFTETRACYCLINESINDARKCOLOREDHONEYSBYHIGHPER
46、FORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYUSINGPOLYMERICCARTRIDGEANDMETALCHELATEAFFINITYCHROMATOGRAPHYJFOODHYGSOCJPN,2008,49319621CARRASCOPANCORBOA,CASADOTERRONESS,SEGURACARRETEROA,ETALREVERSEDPHASEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYCOUPLEDTOULTRAVIOLETANDELECTROSPRAYTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYONLINEDETECTIONFOR
47、THESEPARATIONOFEIGHTTETRACYCLINESINHONEYSAMPLESJCHROMATOGRA,2008,11951210722LIUY,XUJZ,DINGT,ETALDETERMINATIONOFTETRACYCLINESINHONEYUSINGLIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHULTRAVIOLETABSORBANCEDETECTIONANDRESIDUECONFIRMATIONBYMASSSPECTROMETRYCHINJCHEM,2007,259129423CASADOTERRONESS,SEGURACARRETEROA,BUSIS,ETALDET
48、ERMINATIONOFTETRACYCLINERESIDUESINHONEYBYCZEWITHULTRAVIOLETABSORBANCEDETECTIONELECTROPHORESIS,2007,2816288224PENAA,PELANTOVAN,LINOCM,ETALVALIDATIONOFANANALYTICALMETHODOLOGYFORDETERMINATIONOFOXYTETRACYCLINEANDTETRACYCLINERESIDUESINHONEYBYHPLCWITHFLUORESCENCEDETECTIONJAGRFOODCHEM,2005,5310378425VIASP,
49、BALSALOBREN,LPEZERROZC,ETALLIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHULTRAVIOLETABSORBANCE16DETECTIONFORTHEANALYSISOFTETRACYCLINERESIDUESINHONEYJCHROMATOGRA,2004,10221212526NAKAZAWAH,INOS,KATOK,ETALSIMULTANEOUSDETERMINATIONOFRESIDUALTETRACYCLINESINFOODSBYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYWITHATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONTANDEMMASSSPECTROMETRYJCHROMATOGRB,1999,73215527KACZMAREKM,LISSCHEMILUMINESCENCEDETERMINA
