1、（20届）本科毕业设计固相微萃取高效液相色谱法测定己烯雌酚DETERMINATIONOFDESBYSOLIDPHASEMICROEXTRACTIONCOUPLEDANDHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY所在学院专业班级化学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I摘要【摘要】建立应用固相微萃取（SPME）高效液相色谱（HPLC）法测定食品中的己烯雌酚（DES）的分析方法。探讨了萃取纤维、萃取时间、解吸时间和离子强度对DES萃取效率的影响，并采用正交试验，以解析液组成、萃取液PH和搅拌速度为3因素筛选出了最佳固相微萃取条件。结果表明，在室温下，采用85M聚酰胺PA
2、萃取纤维头，萃取原液中不添加盐（NACL）且不做任何PH处理，搅拌速度为600R/MIN，萃取时间为30MIN，解吸时间为10MIN时，对DES萃取效果最佳。本方法对DES测定的线性范围为002200G/ML，工作曲线线性良好，线性相关系数为09961，方法检出限（S/N3）为0006G/ML，测定结果的变异系数小于5。将该法用于鸡肉和牛奶中DES的测定，不同加标水平的回收率为846913和819931。【关键词】固相微萃取；高效液相色谱；己烯雌酚；食品IIDETERMINATIONOFDESBYSOLIDPHASEMICROEXTRACTIONCOUPLEDANDHIGHPERFORMANC
3、ELIQUIDCHROMATOGRAPHYABSTRACT【ABSTRACT】ANOVELMETHODFORTHEDETERMINATIONOFDESBYSPMEHLPCWASDEVELOPEDINFOODDISCUSSEDTHEINFLUENCEOFEXTRACTIONFIBER,EXTRACTIONTIME,DESORPTIONTIMEANDIONICSTRENGTHTODESEXTRACTEDEFFICIENCY,ANDUSINGTHEORTHOGONALTEST,TAKINGANALYZEDLIQUID、EXTRACTEDLIQUIDPHANDTHEMIXINGSPEEDAS3FACT
4、ORSFILTEREDTHEBESTSPMETHERESULTINDICATEDTHATUNDERTHEROOMTEMPERATURE,ADOPTING85MGATHERSTHEAMIDEPAEXTRACTIONFIBERHEAD，NOANADDITIONOFTHESALTNACLANDNOPHPROCESSINGINTHEEXTRACTIONORIGINALFLUID,THESOLUTIONBEINGSRIRREDAT600R/MIN,EXTRACTIONTIMEAT30MINUTES，DESORPTIONTIMEAT10MINUTES，WITCHWASTHEBESTFORTHEEXTRAC
5、TIONEFFECTOFDESTHEMETHODISLINEARFORDESOVERTHERANGEASSAYEDFROM002TO200G/MLWITHTHEDETECTIONLIMITS（S/N3）OF0006G/MLANDTHECORRELATIONCOEFFICIENTSOF09961THISDETERMINATIONRESULTOFTHECOEFFICIENTVARIATIONWASSMALLERTHAN5THEMETHODWASAPPLIEDTOTHEDETERMINATIONOFDESINCHICKENASFOODANDMILKPOWER，ANDTHEDIFFERENTRECOV
6、ERYRATESOFDETECTEDSAMPLESRESPECTIVELYWERE846913AND819931【KEYWORDS】SOLIDPHASEMICROEXTRACTIONSPMEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY（HPLC）DESFOODIII目录1引言111固相微萃取112正交试验42实验部分421仪器与试剂522色谱条件523实验方法5231标准溶液5232样品处理5233操作方法53结果与讨论631色谱条件的优化6311检测波长6312流动相（解吸液）的选择632萃取条件的优化6321萃取纤维的选择6322萃取时间的优化6323解吸时间的优
7、化7324离子强度的影响8325解吸液组成、萃取液PH值（盐酸和氢氧化钠）及搅拌速度的影响833工作曲线的绘制10331工作曲线10332重现性试验10333检出限1034精密度和加标回收率1035注意事项12351样品前处理12352提取方法的选择124总结12参考文献14致谢错误未定义书签。11引言己烯雌酚属激素类药物，是一种人工合成的非淄体雌激素，别名人造求偶素，其结构与天然雌激素的分子状况很相似，无色结晶粉末，能溶于甲醇，乙醇，乙醚，氯仿，脂肪油，强碱溶液中，几乎不溶于水。因其能促进蛋白合成，加快增重和骨骼钙化，提高动物的生长速度，并减少饲料消耗，被用作鸡，牛，羊等畜禽促长增肉剂；同时
8、在水产养殖、女性丰胸化妆品的方面也有使用。许多科学实验已经证实，己烯雌酚是一种致癌物质，可以在动物的肝脏、肌肉、脂肪等处残留，会给消费者带来不良的生理影响（儿童性发育异常，男性出现女性特征），损害肝肾功能，甚至可诱发白血病、子宫癌等疾病，对人和动物都有着较大的危害。目前，世界上多国家禁止在食品中使用己烯雌酚。而对于己烯雌酚仍存在的滥用现象，其残留的检测分析引起了国内外的高度重视。1979年美国、加拿大及欧盟宣布禁用，之后，我国在国标中也对其使用做出了严格要求，除了作为治疗药物使用，DES在动物性食品和动物组织中要求零检出1。对己烯雌酚（DES）检测的方法,居国内外已有文献报道28主要有酶联免疫
9、测定法、放射免疫法（RIA）、气相色谱质谱法（GCMS）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、汽液色谱法（GLC），辐照分光光度法生物分析法，而从前人大量的DES残留量测定实验研究来看，它在动物组织或动物性食品中残留度很低，这就要求我们能测定出极低的浓度的DES，在对样品进行预处理时，我们选用具有富集作用的固相微萃取（SPME），使待测液的浓度达到HPLC的检出范围。本试验研究建立的采用SPMEHPLC法对己烯雌酚的检测方法，积极探讨了此方法的最优条件。11固相微萃取试样的预处理910是样品分析中至关重要的一环，其目的在于减小杂质对待测无的干扰及对试样的痕量待
10、测组分进行预富集,其方法有超声波萃取、固相萃取（SOLIDPHASEEXTRACTION，SPE）、液液萃取等。固相微萃取技术（SPME）11即为其中的一种，它操作步骤简单，不需要大量溶剂，集采集、萃取、浓缩于一体，且具有萃取速度快、灵敏度高、便于实现自动化以及易于色谱、电泳等高效分离检测受锻炼用等突出的优点。一般而言，可采用气相色谱（GC）进行分析检测的化合物均采用SPME方法进行萃取分析，即用于GC的进样系统而形成SPMEGC联用技术，并迅速成熟。另一方面，由于GC只适用于强挥发性或中等挥发性的中低极性化合物的分析，而对于低挥发性或不挥发性的高极性物，如药物、肽、蛋白质、强极性的杀虫剂等，
11、高效液相色谱（HPLC）则具有比GC更多的优势12。因此，自1995年，CHEN等人13首先设计出SPMEHPLC联用仪器的接口装置，并以稠环芳烃考察了了这种方法的分析性能，得到了较好的效果，并证明此方法与一般的HPLC直接进样方法在分析性能上无差别，到其由最初的手动方式又发展为自动化的管内（INTUBE）方式，并在涂层材料的研究、分2离条件的优化及应用领域的拓宽上都有了新的发展。SPMEHPLC联用技术得到进一步完善。传统的固相微萃取装置由在微量进样器中插入一段涂有萃取相的石英纤维构成，并依据分析物在萃取相与式样之间的扩散、吸附而实现萃取。党萃取达到平衡时，进入萃取相的分析物的量N为（1）其
12、中，C0为萃取前分析物在样品中的浓度；KFS为分析物在萃取相和试样间的分配系数；V1为萃取相的体积；V2为样品的体积。SPMEHPLC联用中的萃取过程亦遵循此原理进行。EISERT等人建立了管内SPMEHPLC方式中待测物在毛细管内沿轴向随时间T而变化的浓度分布数学模型其中，U为流动相的速度；K为分配比，K4KFSDS/DC,KFS定义同式1,DS为萃取涂层的厚度,DC为毛细管的内径为样品前沿分布的均方差,HTU/1K1/2,H为塔板高。在样品为较洁净水样的情况下,依此模型可以推测待测物任意时间在毛细管中的浓度分布情况。从式2中可看到,待测物前沿在毛细管内的移动速度与试样的流速成正比,而与待测
13、物在两相中的分配系数成反比。若毛细管较短而样品带分散较小,完成萃取所需的时间TE可认为是样品带的中心到达毛细管末端的时间,即其中,L为涂覆有萃取相的毛细管的长度。从式3可知,萃取达到平衡所需的时间与毛细管的长度成正比,与溶液的流动速度成反比。待测物在两相中的分配系数增大与萃取涂层的体积增加,都将导致萃取时间的延长。若流动相的流速很大以致产生扰动,且待测物的分配系数较小时,萃取达到平衡的时间可由式4估算TET95DS/2DS4其中,DS为待测物在涂层中的扩散系数。SPMEHPLC联用得以实现的关键在于其解吸过程是否能与HPLC进样系统匹配,即能否使解吸液的体积足够小,以避免在进样后产生明显的柱外
14、效应或出现超载现象而导致色谱峰严重拓宽,致使分辨率下降,直接影响分析的灵敏度。例如,若涂层厚度为7M,待测物的扩散系数为1010M2/S,在流动相连3续流动而待测物在流动相中有较好的溶解度的情况下,依据式4,解吸过程将在1S内完成。由于待测物都将集中在解吸液的前部,因此可以以很少的解吸溶剂完成解吸过程,使进样体积足够小。CHEN等人以苯并芘为考察对象,在以乙腈水体积比为9010为流动相时,得到了012L的解吸体积,没有出现超载。由于不同的待测物在流动相中的溶解度不同将导致解吸体积发生较大的变化,因此应在操作中针对不同的分析对象选择合适的解吸溶剂。SPMEHPLC联用接口为满足HPLC对于进样的
15、要求，避免因进样体积过大而产生明显的柱外效应，同时又能保持SPME分析速度快、操作简便、溶剂消少的优点，先后设计出了手动式、自动化管内SPMEHPLC联用式等接口装置。如下图结构图1手动式SPMEHPLC联用接口结构图2管内SPMEHPLC联用方式接口萃取头涂层萃取头是SPME装置的装置的核心,其涂层的性质已经成为SPME方法成功与否的关键。与其他萃取方法一样,SPME萃取头涂层同样是遵循“相似相溶”的原则,如同毛细管色谱柱的选择一4样,没有一种萃取头能够萃取所有的化合物。萃取头涂层的极性与厚度必须与分析物的性质相匹配,具有极性较强涂层如聚丙烯酸酯PA的萃取头适合于萃取极性化合物,而具有非极性
16、的聚二甲基硅氧烷PDMS涂层的萃取头则主要用于非极性化合物的萃取。理想的萃取头涂层应能满足下述四方面的要求对于分析物要有较强的萃取能力、能在较短时间内达到吸附平衡、热解吸时分析物能迅速地从萃取头上解吸、所选萃取头必须具有良好的热稳定性。萃取时间的确定为了获得高灵敏度并减小环境因素的影响，本试验采用平衡采样，即当分析物在采样相与样品间达到分配平衡后再停止萃取。对可能影响平衡时间的环境因素，如PH、缓冲溶液浓度以及盐度，进行了考察，在环境水样的常见PH（58），缓冲容量（5200MMOL/L）以及盐度（0500MMOL/L）范围内，选取达到萃取平衡的时间即为萃取时间。测定样品DES的原理样品均浆后
17、，经甲醇提取过滤，通过HPLC色谱分离，用紫外检测器检测，根据RT定性。在波长230NM处测定吸光度，同条件下绘制工作曲线，DES含量与吸光度值在一定浓度范围内成正比，样品与工作曲线比较，进行定量。计算（3）式中X样品中己烯雌酚浓度,G/KG；C1外标法或标准曲线求得己烯雌酚的含量,G；V2注入样品提取液的体积,ML；V1样品提取溶液浓缩后定容体积,ML；M样品质量,G。12正交试验正交试验1415正交设计法是一种科学地安排与分析多因素试验的方法。在色谱分离条件选择中的应用日益广泛。正交试验设计可得出更佳、更可靠的实验条件，且体系的灵敏度和选择性有了很大的改善和提高，正交设计试验能明确各因素在
18、体系中的影响程度，指导试验操作，提高测试质量，正交设计试验法是科学安排试验的方法，效果好，经济，快速，在分析测试中值得推广应用。2实验部分521仪器与试剂日本岛津公司LC10AT高效液相色谱仪配紫外检测器、25L微量进样器、固相微萃取装置（美国SUPELCO公司）、萃取头纤维涂层为聚二甲基硅氧烷（PDMS，100M）和聚丙烯酸酯（PA,85M）、自制吸附解吸操作平台、小型绞肉机、离心机、超声波振荡器、045M滤膜、电子天平。己烯雌酚标准品（ACROS,NEWJERESTRONE,USA,99），甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），鸡肉、奶粉（购自农贸市场）22色谱条件色谱柱SHIMPACKVPOD
19、SC18150MMX46MM，粒径5M；柱温25；流动相甲醇水（7030），用磷酸调PH5；流速07ML/MIN；检测波长230NM；进样体积20L23实验方法231标准溶液A己烯雌酚标准储备液准确称取01G（精确至00001G）己烯雌酚（DES）溶于少量甲醇，移入100ML棕色容量瓶中加甲醇至刻度，混匀，配成储备，此溶液每毫升含DES10MG，避光保存于，有效期为一个月。B己烯雌酚标准使用液准确吸取1MLDES储备液,装入100ML棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,此溶液每毫升含DES100G。不同浓度梯度的DES标准水溶液（001、002、005、01、05、10、20G/ML）由DES标准
20、使用液用去离子水逐级稀释而得。232样品处理A鸡肉取适量鸡肉于搅拌器中搅拌成肉糜状，称取3份10G绞碎小于5MM的鸡肉样品,每份进行如下操作放入25ML比色管中,加100ML甲醇,充分搅拌,至振荡器中振荡10分钟,将上清液移除,残渣中再加100ML甲醇,混匀后振荡10分钟,合并上清液,于2000RPM离心10分钟,取上清液过045M滤膜,得滤液。B奶粉准确称取3份30G混合均匀的奶粉试样,每份进行如下操作装入50ML具塞三角瓶中,加入甲醇充分搅拌,超声波提取15分钟，倾出上层溶液，如此反复3次,合并提取液，于70水浴浓缩,以甲醇定容至10ML容量瓶离心取上清液过045M滤膜,得滤液。C所得的六
21、份样品试样,添加1G/MLDES标准液,用去离子水配制成浓度为01、10、15G/ML的溶液，备用，待测。同时做样品空白。233操作方法6萃取头首次使用前用甲醇活化20MIN，室温条件下风干。准确量取5ML10G/MLDES标准溶液于萃取瓶中，放入磁力搅拌子，将SPME不锈钢针管插入瓶中，推动SPME装置的手柄，将萃取头推出浸入待测溶液内，调节萃取头的位置，使搅拌子在搅拌时不会损伤萃取头，且萃取头完全侵入溶液中。以600R/MIN的速度进行搅拌萃取30MIN。萃取完成后，将萃取头转移到装有40L流动相的自制解吸装置中静态解吸10MIN，然后将解吸液直接进行色谱分析。3结果与讨论31色谱条件的优
22、化311检测波长经过扫描确定己烯雌酚在230，280NM处都有较好的吸收。在相同的分离条件下，分别用230，280NM波长对加标样品进行检查，试验发现在230，280NM波长处测定都能有效分离，并克服共存干扰物的影响，而230NM波长下吸收大得多。本试验采用230NM波长进行检测。312流动相（解吸液）的选择用磷酸调整流动相PH值时，如果PH试纸指示酸碱度，每次所配制的流动相PH值会存在一定差异，更换流动相后样品分析的保留时间会出现差异。因此，建议在磷酸调整流动相PH值时，第一次用PH计定位，记录配置500ML或1000ML流动相需加入磷酸的量，再以后的流动相配置中按体积加入相应的磷酸量，以保
23、证PH值得一致性，减少保留时间的漂移。经对流动相甲醇水9010、7030、5050的考察,发现7525时,己烯雌酚和羟苯乙酯与基质分离效果好,溶剂峰少,基质干扰最少,保留时间最为适宜,故选定流动相为甲醇水7030。32萃取条件的优化321萃取纤维的选择考虑了100MPDMS和85MPA涂层萃取纤维头对己烯雌酚的萃取效果。PA涂层萃取纤维头对己烯雌酚萃取效果显著高于PDMS涂层萃取纤维头。这是由于己烯雌酚的双酚结构，使其极性得到增加，而具有非极性PDMS涂层萃取头主要用于非极性化合物的萃取，因此，选用适合于萃取极性化合物85MPA涂层萃取头。322萃取时间的优化70102030405001000
24、2000300040005000PEAKHEIGHT/MMEXTRACTIONTIME/MIN图1萃取时间对萃取效率的影响取DES标准水溶液，在预设的方法的条件下，固定其他条件不变，考虑了萃取时间为5MIN、10MIN、20MIN、30MIN、40MIN、50MIN时对萃取效果的影响（如图1所示）。实验结果表明，随着萃取时间的增加，DES的萃取量也逐渐增大。当萃取时间达到30MIN后，萃取量增长幅度逐渐减小，但没有达到稳定的吸附平衡。根据固相微萃取非平衡理论16，一定条件下，萃取量与浓度呈线性关系。兼顾灵敏度和萃取效率，选择较短时间的分析时间，故选择30MIN作为最佳萃取时间。323解吸时间的
25、优化8051015202530354025003000350040004500500055006000650070007500PEAKHEIGHT/MMDESORPTIONTIME/MIN图2解吸时间对解吸效率的影响取DES标准水溶液，根据上述最佳萃取时间30MIN，在室温和搅拌速度600R/MIN考察了解吸时间为2MIN、5MIN、7MIN、10MIN、15MIN、30MIN对解吸效果的影响（图2）。从曲线趋势上来看，在5MIN10MIN内，随着解析时间的增加，解吸量逐渐增加，但增长幅度逐渐减小。当解析时间达到10MIN后，解吸逐渐趋于完成。考虑到本方法快速便捷等综合因素，选择10MIN作为
26、本实验最佳解吸时间。324离子强度的影响在待萃取液中加入一定量浓度的NACL，可以影响溶液电离过程水化的影响，当加入含量较高的盐时，导致待测物在水相中溶解度增加17。少量盐的加入，提高了溶液的极性，有利于纤维对待测物的吸附。由于萃取过程盐吸附在萃取头表面，使纤维头容易损坏18。本实验添加盐的增益不是很大，因此选择不加入盐离子。325解吸液组成、萃取液PH值（盐酸和氢氧化钠）及搅拌速度的影响表1正交试验因素水平表因素水平9123A解吸液（甲醇水）703090105050B萃取液PH值4PH值不作处理9C搅拌速度（R/MIN）06001000选取影响DES富集分离效果各因素中占主要因素的解吸液、萃
27、取液PH值（用HCL、NAOH调制）及搅拌速度做正交试验，每个因素选取3各水平（表1）。表2正交试验结果试验号ABC峰高11111400172122425761431332839741422330163245231636363621227423517332823298313471269932135225K172373723353637112863K2639503876261887823255K3164680942993946327334极差R559056342725516694625因素主次CAB优方案C2A1B2根据所选取的因素水平表，采用正交表L9（33）安排实验，对结果进行极差分析（表2
28、）。通过直观分析表，三因素对DES提取的影响主次顺序为CAB。方差分析结果表明，所选取的个因素对固相10微萃取DES的影响显著，最佳优化条件是C2A1B2，即洗脱液内甲醇与水的配比为7030、萃取液PH值不做任何处理（萃取原液PH在59362之间）、搅拌速度600R/MIN。33工作曲线的绘制0005101520020000400006000080000100000120000140000AREACONCENTRATIONG/ML图3DES工作曲线图331工作曲线分别移取5ML001、002、005、01、05、10、20G/ML己烯雌酚标准工作液，按照最佳优化条件进行固相微萃取处理，在已考察
29、的色谱条件下进行HPLC测定，每种浓度重复3次。将所得峰面积的平均值与所对应的标准溶液浓度进行线性回归分析（见图3）。在0025G/ML范围内绘制工作曲线。结果显示，DES测定的线性范围为002200G/ML，线性回归方程为Y5656617X83485（X/G/ML），具有良好的线性关系（R09961）。332重现性试验在已优化的操作条件下，以1G/MLDES标准水溶液按本法进行重现性实验（N5），其变异系数为382。333检出限高效液相色谱的检测限一般定义为待测物出峰保留时间附近3倍信噪比所对应的待测物的浓度,则按N3，得检出限为0006G/ML。34精密度和加标回收率11表3鸡肉组织和奶粉
30、样品的空白及加标回收率样品加标量（G/ML）测定值（G/ML）回收率（，N3）鸡肉组织00ND1008468463615137091333奶粉样品00ND1008198193915139693129ND未检出（NOTDETECTED）0246810120002040608101214024681012000204060810121416VOLTAGE/MVTIME/MINABVOLTAGE/MVTIME/MINDES图4（A添加1G/MLDES，B空白）鸡肉样品峰谱图12024681012000510152025024681012000204060810121416VOLTAGE/MVTIME
31、/MINDESAVOLTAGE/MVTIME/MINB图5（A添加1G/MLDES，B空白）奶粉样品峰谱图以空白鸡肉样品和奶粉样品为底本,按样品处理步骤样品添加浓度为10G/MLDES标准液，用SPMEHPLC测定鸡肉样品（图4）和奶粉样品（图5）的加标回收率。每个样品平行侧3次，测得的加标回收率分别为846913和819931。结果表明本方法具有较高的准确性。35注意事项351样品前处理时应注意鸡肉样要切碎5MM,定容好的提取液要先经过离心,再经045M滤膜过滤,以防止微粒堵塞柱前滤片。352提取方法的选择国家标准19规定，以甲醇为提取剂，于振荡器上振荡提取，这种提取方法操作较为繁琐，提取时
32、间较长，而采用超声波提取，则快速简便，不仅可大大提高工作效率，且回收率、重现性均令人满意。4总结优化了SPMEHPLC的实验条件，研究建立了适用于禽畜肉、奶粉等食品中DES测定的新方法。该方法简便、迅速、溶剂消耗少、集试样预处理与分析检测于一体，且数据重现性良好，变异系数小于135，最低检出限为0006G/ML，鸡肉和奶粉样品加标回收率分别为846913和819931。14参考文献1陈眷华,王文博,徐在品,等己烯雌酚残留的三种检测方法比较研究J食品科学,2006,27921422182包玉红，孙梅梅，高素芹，等分析实验室，2010,29（2）23253JCBRAVO,RMGARCIMUNO,P
33、FERNANDEZJSANALBIOANALCHEM,2007388103910454刘虹，谢承恩应用预防医学，2006,12（6）3743755吴银良，刘素英，侯东军，等色谱，2006,24（5）4624656罗晓燕，林玉娜，现代预防医学，2005,32（4）2872897XIAOMANJIANG,CHUANDEZHAO，ETALFOODCHEMISTRY,2008,108106110678MEIHUALIU,MEIJINLI,BINQIUAANALYTICACHIMICAACTA,2010,66333389赵明桥,李攻科,陈皓等分析试验室,2003,2266010卢平,宋宝安,金林红等农药
34、,2005,44312011胡国栋色谱，2009,27（1）1812GOUYN,EISERTR,PAWLISZYNJJCHROMATOGRA,2000,873113714713CHENJ,PAWLISZYNJBANALCHEM,1995,67152530253314郑用熙分析化学中数理统计的方法北京中国科学出版社,198618015李云雁，胡传荣。试验设计与数据处理。第二版北京化学工业出版社，200812415916JAI,ANALYTICALCHEMISTRY,1997,6961230123617LIHUAYANG,TIANGANGLUAN,CHONGYULANJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2006,1104233218FELIXHEMANDEZ,JOAQUIMBELTRAN,FRANCISOJLOPEZANALCHEM2000,722313232219GB/T50091082003
