1、（20届）本科毕业设计农产品中几种有害染色剂检测技术的研究THEDETECTIONOFSEVERALHARMFULDYESINAGRICULTURALPRODUCTS所在学院专业班级化学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I摘要【摘要】建立了农产品中亮蓝和日落黄超高效液相色谱仪检测的检测方法。样品经乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）振荡提取，再经SAX固相萃取小柱净化，超高效液相色谱仪紫外检测器检测。该分析方法对农产品中亮蓝添加回收率在849990之间，批内变异系数在2983之间，批间变异系数为2243，最低检出浓度为01MG/KG。对日落黄添加回收率在849995之间，批内变异系数在357
2、5之间，批间变异系数为1527，最低检出浓度为01MG/KG。该法操作简便、灵敏、准确，适用于农产品中亮蓝、日落黄的测定。【关键词】亮蓝日落黄；胭脂红；超高效液相色谱仪；SAX固相萃取小柱。IITHEDETECTIONOFSEVERALHARMFULDYESINAGRICULTURALPRODUCTSABSTRACT【ABSTRACT】ANANALYTICALMETHODWASDEVELOPEDTODETERMINERESIDUEOFBRILLIANTBLUEANDCARMINEINAGRICULTURALPRODUCTSSAMPLESWEREEXTRACTEDBYALCOHOLWATERAM
3、MONIAWATER2/1/7,V/V/V,ANDFURTHERCLEANEDUPBYSAXSOLIDPHASEEXTRACTIONCARTRIDGE,ANDDETERMINEDBYUPLCPDATHEAVERAGEFORTIFIEDRECOVERYOFBRILLIANTBLUEINAGRICULTURALPRODUCTSWASINTHERANGEOF917990,THEINTERASSAYCOEFFICIENTOFVARIATIONWASINTHERANGEOF2983,THEINTRAASSAYCOEFFICIENTOFVARIATIONWASINTHERANGEOF2983,THELIM
4、ITOFDETECTIONWAS01MG/KGTHEAVERAGEFORTIFIEDRECOVERYOFCARMINEINAGRICULTURALPRODUCTSWASINTHERANGEOF849995,THEINTERASSAYCOEFFICIENTOFVARIATIONWASINTHERANGEOF3575,THEINTRAASSAYCOEFFICIENTOFVARIATIONWASINTHERANGEOF1527,THELIMITOFDETECTIONWAS01MG/KGTHEMETHODISSIMPLE,SENSIT【KEYWORDS】BRILLIANTBLUESUNSETYELLO
5、WCARMINEUPLCPDASAXSOLIDPHASEEXTRACTIONCARTRIDGE。III目录摘要IABSTRACTII1引言411亮蓝的相关检测技术512日落黄的相关检测技术613胭脂红的相关检测技术72实验部分721试剂材料与试剂722仪器823测定步骤8231提取82311饮料等液体样品82312肉制品等固体样品8232净化824标准曲线的测定925仪器条件926添加回收率实验93结果与讨论1031波长的选择1032流动相筛选1033提取液筛选1134样品净化1135标准曲线1136添加回收1237实际样品中的应用144结论16参考文献17致谢错误未定义书签。附录错误未定义书
6、签。41引言色、香、味、形是评价农产品品质的重要基本参数，在这4个参数中又以色泽的影响最大，因为视觉信息是最直接的感官信息，自然、悦目、和谐的色泽可以增加人们的食欲，提高商品的市场价值。大多农产品都具有一定的天然颜色，但由于其对光、热、酸、碱的敏感，在加工、贮存过程中会发生褪色和变色，为了保持和改善色泽，在加工过程中需要用染色剂进行人工着色。现在具备染色功能的染色剂有天然色素、人工合成色素、工业染料等。天然色素来自天然物，主要由植物组织中提取，也包括来自动物和微生物的一些色素。一般来说，天然色素安全性较好，有些天然色素还具有一定的营养价值。人工合成色素和工业染料均对人体有害。人工合成色素是指用
7、人工化学合成方法所制得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成的，通称煤焦色素或苯胺色素，危害包括一般毒性、致泻性、致突性（基因突变）与致癌作用。工业染料则因为含有大量对人体有害物质，严禁在食品加工行业使用。13近年来，部分不法生产企业及商贩在巨大的经济利益的驱使下，不顾人们的身体健康，唯利是图，用人工合成色素甚至工业染料,将劣质农产品制成具有鲜艳色泽的优质农产品，如用苏丹红饲喂出来的红心鸭蛋；将胭脂红色素和石蜡混合涂在橙子表皮上，原本灰头土脸的劣质橙子变得又红又亮；往瓜子里添加亮蓝、石蜡等对人体有害的工业原料来节约成本、提高瓜子的品相；4将用化工染料日落黄等给小黄鱼穿衣，掩盖
8、鱼体已经不新鲜的缺陷；用黑色素、亮光剂将白芝麻、白米当成黑芝麻、黑米；孔雀石绿用在桂花鱼的消炎以及防腐上，可以使鱼看起来更光鲜；在面粉中添加柠檬黄制作玉米馒头等等，染色农产品事件层出不穷，不但冲击了守法经营户的利益，扰乱了经营秩序，而且对消费者产成严重的健康危害，也严重影响到我国的形象,造成了极大的损失。世界各国尤其是西方发达国家不仅在色素对人体健康影响方面做了大量调查和研究，而且在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定，多种合成色素已被禁止或严格限量使用。工业染料更是严禁在食品中进行应用研究。在丹麦，研究人员建议，与其禁止在食品中添加色素，不如在食品标签上标明添加色素的类型。通过这
9、种方法，消费者可以对食品作出是否购买的决定。此外，丹麦政府还决定禁5止在基本食物中使用色素，并要求所有添加的色素都必须在食品标签上注明。其他国家则更严格地限制某些色素，特别是偶氮类色素在食品中的使用。经过多年的努力，现在可以合法使用的食用合成色素品种已经大为减少。在世界各国使用合成色素最多时，品种多达100余种，日本曾批准使用的合成色素有27种，现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种，现仅剩下7种。瑞典、芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素，其中挪威等一些国家还完全禁止使用任何化学合成色素。此外还有一些国家已禁止在肉类、鱼类及其加工品、水果及其制品、
10、调味品、婴儿食品、糕点等食品中添加合成色素。我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制凡是肉类及其加工品、鱼类及其加工品、醋、酱油、腐乳等调味品、水果及其制品、乳类及乳制品、婴儿食品、饼干、糕点都不能使用人工合成色素。只有汽水、冷饮食品、糖果、配制酒和果汁露可以少量使用，一般不得超过1/10000。新实施的食品安全法第二十八条明确禁止生产经营“用非食品原料生产的食品或者添加食品添加剂以外的化学物质和其他可能危害人体健康物质的食品”。我国在食品行业上开展了天然色素、人工合成着色剂的检测技术研究并形成了一批国家标准，如食品中合成着色剂的测定（GB/T5009352003），食品中诱惑红的测定（GB/
11、T50091412003），食品中核黄素的测定（GB/T5009852003）等，但这些方法主要是用于桔子水、酒类、硬糖、蜜饯、巧克力等食品，尚未有用于农产品的合成色素检测方法。在食品中工业染料的检测方法更少，仅有的一个苏丹红染料的检测方法食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法（GB/T196812005）。2008年12月，我国卫生部在为了配合打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治行动，公了第一批“食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单”，其中包括17种非食用物质和10种易滥用的食品添加剂，其中就包含了苏丹红、酸性橙、美术绿、工业染料等用来上色的非食用物质，但目
12、前除了苏丹红有标准的检测方法外，其余用于染色的非食用物质均无相关的检测方法。本文对近年来对亮蓝、日落黄和胭脂红的检测技术的研究进行了简单的综述。11亮蓝的相关检测技术近年来对亮蓝研究方法探讨的有杭州市疾病预防控制中心的戚荣平，邱晓枫，胡薇薇等利用反相高效液相色谱法采用等度洗脱，以甲醇乙酸铵002MOL/L，PH4064为流6动相，采用AGILENTTCC18416250MM，5UM色谱柱，在595NM的检测波长下对亮蓝定性定量检测。结果峰面积与亮蓝含量在1100UG/ML浓度范围内呈良好线性关系，相关系数R09999，测定相对标准偏差均小于1，回收率在90909750之间，检出限为010UG/
13、ML。该方法简便、灵敏、准确，便于实验室开展工作，避免了梯度洗脱造成的基线漂移等不足。5另外南昌航空大学环境与化学工程学院课题组的吴美剑，颜流水等人建立了一种高效液相色谱串联质谱联用快速测定饮料中亮蓝的新方法。6使用脱气、调节PH等简单的样品前处理后，利用HPLCESIMS/MS对亮蓝二级特征离子M/Z735进行定性定量检测，5MIN内即可完成，方法检出限为02G/KG，加标样品回收率在920978，相对标准偏差3557。该方法简便、快速、灵敏度高，抗干扰能力强，适用于饮料中亮蓝的痕量检测。李祝，肖洋等在627NM波长下，以甲醇乙酸铵溶液002MOL/L为4555为流动相，进行高效液相色谱分析
14、，以保留时间定性，与标准比较定量。其回收率为940983，最低检出浓度为001MG/KG；该方法灵敏度高，色谱峰分离效果好，具有良好的稳定性和重现性，能够为啤酒质量安全监督提供科学依据。712日落黄的相关检测技术程小会，邓敬颂等人采用ODSC18型250MM46MM色谱柱，甲醇002MOL/L乙酸铵体积比4060，PH4为流动相，流速为06ML/MIN，用紫外检测器在510NM检测波长下分析检测果蔬汁中的日落黄。8该方法测定结果的相对标准偏差为23，平均回收率为8833。测试结果稳定且精确度较高，能够满足检测要求。鄢兵，龙洲雄，万春花等，色谱柱采用KROMASILC18柱（5M，46MM250
15、MM），流动相A泵乙腈B泵甲醇002MOL/L乙酸铵892（V/V），流速10ML/MIN，室温下双波长检测（254NM和428NM）饮料中日落黄的含量，平均回收率为888。9此方法具有快速、准确、简单以及灵敏度高等优点，结果令人满意。谢连宏采用C18型5M，250MM45MM色谱柱，紫外检测器（检测波长254NM），以甲醇002MOL/L乙酸铵为流动相，流量为10ML/MIN，测玉米面中日落黄的含量。回收率均在95一98之间，此方法的分离效果较好，每次分析后无须重新平衡色谱柱。10713胭脂红的相关检测技术蒋阿宁，管建慧系统研究了食用合成色素胭脂红含量的测定方法，并对目前市场上常见的四大类1
16、6种食品的胭脂红含量进行了测定。11其研究表明，采用HPLC法，测定食品的合成色素含量是一种精密度和准确度都较高的检测方法，为食用合成色素的检测提供了有效的途径。潘兆平，付复华采用聚酰胺粉法提取膨化食品中日落黄、胭脂红、亮蓝，湿法装注射器管小柱。用高效液相色谱法，二极管阵列检测器进行梯度洗脱，一次测定3种物质，在选定的条件下，3种色素在测定范围内线性关系良好；相对标准偏差均小于12，方法精确度较高；回收率在8991072之间，分离效果好。1214陈夏芳等用高效液相色谱法测定肉制品中人工合成色素，肉制品经石油醚脱脂后,采用乙醇氨水V/V6040溶剂提取,超声波70振荡10MIN后过滤,采用HPL
17、C系统以002MOL/L乙酸铵和甲醇梯度洗脱,外标法峰面积定量。15结果表明,5种食用合成色素最低检测限均低于现行国家标准要求,回收率8096,相对标准偏差在110316,此法适用于肉制品中色素测定，但过程较繁琐。本文采用超高效液相色谱法对食品中的胭脂红、日落黄、亮蓝的测定进行了系统的研究，以甲醇和乙酸铵为流动相，选择梯度洗脱方式,采用非均一的各组分的最大吸收波长作为检测波长，实现了几种化合物的测定。经实际样品检测和分析性能研究表明,该方法分离效能好，准确度高，结果稳定可靠，满足农产品中几种色素残留的测定要求。2实验部分21试剂材料与试剂乙醇、氨水为分析纯；甲醇为色谱纯；亮蓝标准品，纯度900
18、，DREHRENSTORFER；日落黄标准品，纯度900，DREHRENSTORFER；胭脂红标准品，纯度900，DREHRENSTORFER；标准储备液用水甲醇（11），分别溶解亮蓝、日落黄、胭脂红标准品，配制成1000MG/L储备液，试验中按需用水甲醇（11）稀释；固相萃取柱SAX小柱500MG/3ML。822仪器超高效液相色谱仪配备紫外检测器，美国WATERSUPLC；BS110S电子天平精确到00001G，SARTORIUS公司；802离心机，上海手术器械厂；XHC漩涡混合器，江苏常州；BUCHI/RII/R210旋转蒸发仪，广州尚准仪器有限公司。23测定步骤231提取2311饮料等液
19、体样品用移液管吸取50ML饮料样品于250ML烧杯内,放置于60C电热板上加热，除去二氧化碳后，再稀释5倍，稀释液15000RMP离心5MIN后，取上清液待测定。2312肉制品等固体样品取10G准确至00LG经搅碎混匀样品于200ML样品瓶中，用30ML乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）振荡提取20MIN后，4000RMP离心5MIN，上清液转入150ML旋转蒸发瓶中，重复两次，并将提取液合并到旋转蒸发瓶中；样液在55条件下，旋转蒸发近干。用10ML水甲醇（11）分三次清洗旋转蒸发瓶，并将清洗液转移到10ML试管中，待净化。232净化将SAX固相萃取小柱，用3ML甲醇和3ML水依次条件化，当
20、溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即将2ML上述待净化溶液上样，而后依次用3ML水、3ML20甲酸水溶液和3ML甲醇淋洗柱子，弃去全部流出液；最后用15ML乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）洗脱，收集洗脱液于50ML浓缩瓶中。将盛有洗脱液的浓缩瓶，在40水浴条件下旋转蒸发近干，残渣用10ML水甲醇（11）溶解并定容至10ML离心管中，15000RMP离心5MIN后，取上清液待测定。924标准曲线的测定分别准确配制亮蓝、日落黄和胭脂红010MG/L、020MG/L、050MG/L、10MG/L、20MG/L的标样工作液，进超高效液相色谱仪紫外检测器。25仪器条件色谱柱ACQUITYUPLCBEHC
21、1821100MM,17M；流动相甲醇002MOL/L乙酸铵水溶液；柱温40；流速02ML/MIN；亮蓝波长628NM；日落黄波长480NM；胭脂红波长508NM；进样量5L。表1流动相梯度表时间甲醇002MOL/L乙酸铵水溶液0109030307040505070505071109010109026添加回收率实验设添加水平为1MG/KG、4MG/KG和8MG/KG，并设空白对照，重复5次。样品处理同23。103结果与讨论31波长的选择由图1可以看出亮蓝在628NM有最大吸收，通过具体试验证明，在628NM处没有杂质影响，所以将亮蓝检测波长定位628NM。由图2可以看出日落黄在483NM有最大
22、吸收，通过具体试验证明，在628NM处没有杂质影响，所以将亮蓝检测波长定位483NM。由图3可以看出胭脂红在510NM有最大吸收，通过具体试验证明，在628NM处没有杂质影响，所以将亮蓝检测波长定位510NM。图1亮蓝光谱图图2日落黄光谱图图3胭脂红光谱图32流动相筛选选用甲醇水，甲醇乙酸铵等作为流动相，通过不断改变流动相梯度和流速，依次对亮蓝进样。结果显示当流动相为甲醇水时，三种色素的峰形相当差，并且灵敏度极低；然后往水中加入乙酸铵调节峰形，调节乙酸铵浓度分别为001、002、003和004MOL/L，结果显示当乙酸铵浓度为002MOL/L时取得的亮蓝、日落黄、胭脂红色谱图峰型和灵敏度都达到
23、最好，所以选择甲醇002MOL/L乙酸铵作为流动相。1133提取液筛选选用水、乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）、甲醇水（1/1，V/V）和甲醇四种提取体系。通过试验，当提取液为水时，亮蓝回收率只有10左右；当提取液为甲醇水，亮蓝回收率也仅有4065之间；当提取液为甲醇时，亮蓝回收率也只在3554之间；而乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）提取体系在样品中回收率保持在75102之间，并且回收率稳定，因此最后选择乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）作为提取液。34样品净化对于饮料等液体类样品，由于含杂质少，干扰小，除去二氧化碳后，直接稀释上样即可。为净化肉制品等固体样品，我们选择了C18小柱、
24、弗罗里硅土、硅胶柱和SAX小柱等三种固相萃取小柱，通过优化固相萃取小柱的条件，得到的结果显示C18小柱、硅胶小柱和弗罗里硅土无论在何溶液均不能吸附亮蓝，而是随大量杂质直接流出，直接进样得到谱图干扰很大；只有SAX小柱不仅能吸附亮蓝，并且通过淋洗液清洗掉杂质，通过洗脱液洗脱、浓缩后上样，无杂质干扰。此外为净化样品，我们选择了硅胶、弗罗里硅土和活性炭填料净化样品。结果显示，硅胶、弗罗里硅土，无法做到杂质和亮蓝等色素的分离，进样得到谱图干扰很大；活性炭吸附亮蓝等过紧，不能解吸。35标准曲线准确配制亮蓝010MG/L、020MG/L、050MG/L、10MG/L、20MG/L的标样工作液。亮蓝标准曲线
25、为Y307440X12969，R209991；准确配制日落黄010MG/L、020MG/L、050MG/L、10MG/L、20MG/L的标样工作液。亮蓝标准曲线为Y126921X34441，R209994；准确配制胭脂红010MG/L、020MG/L、050MG/L、10MG/L、20MG/L的标样工作液。亮蓝标准曲线为Y104995X15343，R209998。表2标准曲线标准溶液浓度（MG/L）峰面积亮蓝日落黄胭脂红1201272721178699860248519219401946505132377559344909510288988124779104322206062712506412
26、08440图4标准曲线图36添加回收采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对亮蓝，日落黄，胭脂红进行了3次添加回收率实验，每个浓度点进行5次重复，实验结果见表3。从表3可见，亮蓝添加回收率在849990之间，批内变异系数在2983之间，批间变异系数为2243，最低检出浓度为01MG/KG；日落黄添加回收率在886995之间，批内变异系数在3575之间，批间变异系数为1527，最低检出浓度为01MG/KG；胭脂红的添加回收345500之间，变异系数在2983之间，最低检出浓度为02MG/KG。表3样品添加回收率色素添加浓度平均回收率批内RSD批间RSD13（MG/KG）,N5亮蓝191785784
27、961598343492491988746296122899092897149725533日落黄193591788660567527496594593847355215899595794952457025胭脂红13953853456159837144553983824629619385004854624972554014图5亮蓝标样图6亮蓝样品空白图7亮蓝样品添加图8日落黄标样图9日落黄样品空白图10日落黄样品添加图11胭脂红标样图12胭脂红样品空白图13胭脂红样品添加37实际样品中的应用在市售的商品中，选取了一种碳酸类饮料和牛肉，按照23对样品进行了处理，并对亮蓝，日落黄，胭脂红进行了3次添
28、加回收率实验，结果显示，在饮料中均检出了亮蓝和日落黄，其平均回收率分别为935和915。牛肉中，未检出胭脂红。15图14亮蓝图15亮蓝样品图16亮蓝添加图17日落黄图18日落黄样品图19日落黄添加16图20胭脂红图21胭脂红样品图22胭脂红添加4结论对于饮料等液体类样品，加热除去二氧化碳，经045UM滤膜过滤后可以直接用超高效液相色谱仪紫外检测器测定；对于肉制品等固体样品，由于样品含杂质多，干扰大，必须净化后才可以测定。本实验以乙醇水氨水（2/1/7，V/V/V）振荡提取，再经SAX固相萃取小柱净化，建立了农产品中亮蓝和日落黄残留量的超高效液相色谱仪紫外检测器测定方法。17在选定的最佳条件下，
29、该分析方法对农产品中亮蓝添加回收率在849990之间，批内变异系数在2983之间，批间变异系数为2243，最低检出浓度为01MG/KG；对日落黄添加回收率在849995之间，批内变异系数在3575之间，批间变异系数为1527，最低检出浓度为01MG/KG。整个方法具有准确和灵敏的特点，能满足农产品中亮蓝和日落黄定量分析需要；但该方法无法对胭脂红进行准确的测定。因时间等原因，未对胭脂红进行进一步的研究，对肉制品等固体样品中胭脂红的净化方法有待进一步研究。参考文献1RONGLIZITAO，JIANGRENXIANGWANGSOLIDPHASEEXTRACTIONCOMBINEDDIRECTSPEC
30、TROPHOTOMETRICDETERMINATIONOFBRILLIANTBLUEINFOODUSINGCYCLODEXTRINPOLYMERJFOODANALMETHODS2009,22642702MGKISELEVA,VVPIMENOVA,KIELLEROPTIMIZATIONOFCONDITIONSFORTHEHPLCDETERMINATION18OFSYNTHETICDYESINFOODJJOURNALOFANALYTICALCHEMISTRY,2003,586856903MANNANHAJIMAHMOODIMOHAMMADREZA,OVEISINAFICEHSADEGHIBEHRO
31、OZ,JANNATELHAMNILFROUSHSIMULTANEOUSDETERMINATIONOFCARMOISINEANDPONCEAU4RJFOODANALMETHODS2008,12142194GB/T969562008肉制品胭脂红着色剂测定中国国家技术监督局2008S5戚荣平,邱晓枫,胡薇薇,高效液相色谱法测定着色剂亮蓝的探讨J中国卫生检验杂志,2008,18130346吴美剑,颜流水,郑鄂湘,等高效液相色谱串联质谱法快速测定饮料中亮蓝J福建分析测试,2009,18421237李祝,肖洋高效液相色谱法测定苦瓜啤酒中的亮蓝J酿酒科技,2008,1664112138程小会,邓敬颂液相色谱
32、法测定果蔬汁中柠檬黄和日落黄方法优化J化学分析计量,2010,19270719鄢兵,龙洲雄,万春花,等HPLC法同时测定饮料中柠檬黄和日落黄J现代测量与实验室管理,2007,144131510谢连宏玉米面中柠檬黄和日落黄的高效液相色谱测定法J环境与健康杂志2008,251092211蒋阿宁，管建慧利用HPLC法进行胭脂红含量的检测J农产品加工学刊,2010,2085677112雷雅娟,徐烨,刘渭萍等高效液相色谱法同时测定食品中的苏丹红、苋菜红和胭脂红J分析试验室,2007,264858813何继宝,汪莉反相高效液相色谱法测定食品中多种合成色素J现代预防医学,2008,35132487249214聂晶,齐兴娟食用合成色素研究动态J中国食品卫生杂志,2002,141586015陈夏芳,胡浩军,李韬高效液相色谱法测定肉制品中人工合成色素的研究J中国卫生检验杂志2009,192313314
