1、实验题目： 小鼠腹腔注射筒箭毒碱 ED50 的测定 Determination of Cl-Tubocurarines Median Effective Dose （ ED50） 【实验目的】 了解 ED50 的测定方法、原理、计算过程与意义。 【相关理论】 1关于量反应，质反应： 量反应是指个体上反应的强度并以数量的分级来表示；例如：血压、尿量等。 质反应是指群体中所观察到的某一效应的出现；如：生死、有效或无效。以阳性反应的出现频率或百分数来表示（全或无，阳性率）。 2关于 ED50， LD50，以及治疗 指数 : 能使群体中有半数个体出现某一效应的剂量，称为半数效应量，若此效应为有效，则为
2、半数有效量 ED50， ED50 是质反应的参数。若此效应为死亡时，则为半数致死量 LD50。 治疗指数 = LD50/ ED50=TI，该值越大越好，说明药物越安全 . 可用机率单位正规法或点斜法求出 LD1 ， ED99 ； LD5 ， ED95。 3肌松药分为去极化型和非去极化型两种。 去极化型肌松药的代表为琥珀酰胆碱，其肌松作用不能被抗胆碱酯酶药新斯的明拮抗，反而会加重。 非去极化型肌松药的代表为筒箭毒碱，其肌松作用能被新斯的明解救 。 4测定 ED50， LD50 的意义 可计算治疗指数 TI（ LD50/ ED50），为临床安全用药提供指导。 【实验动物】 小鼠（昆明种 KM），雌
3、雄各半。 【实验器材】 铁丝网，铁架台，天平，注射器等。 【实验方法】 应用点斜法测定 ED50。 应用该方法测定 ED50 时，实验设计必须符合以下 5点要求： 1）动物以 58 组为宜； 2）每组动物数须一致； 3）各组给药剂量应呈现等比数列； 4）各组给药剂量的公比 r = 1.11.6； 5）最大剂量（ Dmax）组的阳性反应率须 80% ，最小剂量（ Dmin） 组的阳性反应率须 20% 【实验方法】 1预实验：目的是为了找出符合上述点斜法要求 5）的 Dmax 和 Dmin。阳性反应判定标准： 20min内小鼠落下 3次（注意排除因互相拥挤而落下所造成的假阳性）。 2确定组数（ n
4、）后，根据 Dmax 和 Dmin，计算各组应给予的剂量， Dmax= rnD min。注意公比 r应在上述要求的范围内，即 = 1.1 1.6。 分别计算出各组应注射的剂量，见下表： Group No. 1 2 3 4 5 6 Dose Dmin rDmin 2Dmi n r3Dmin r4Dmin Dmax = r5Dmin Group No. 1 2 3 4 5 6. Dose Dmin rDmin r2Dmin r3Dmin r4Dmin Dmax = r5Dmin 3正式实验： a 筛选小鼠：将小鼠放在铁丝网上，观察 10 分钟，不掉下来为合格，可以参与实验。此步的目的在于排除假阳性
5、； b 称重、标记； c 给药观察：腹腔注射 ip 筒箭毒碱。每组分别给予相应的剂量。 d 计算阳性率：阳性反应标准：给药后 20 分钟内自铁丝 网上掉下来 3 次者为阳性。 【计算】 小鼠 ip 筒箭毒碱的 ED50 是多少？其 95%可信区间是多少？ 1） lg ED50=Xm-i（ P -0.5） 其中， Xm = lg Dmax ， i =lg r ， P ：阳性率之和 因此， ED50 =lg-1 Xm-i（ P -0.5） 2） ED50 的 95%可信区间 = lg-1 lg ED501.96Sx50 ， 其中， Sx50 为 ED50的标准误： Sx50 = i (P - P2
6、)1/2/(n - 1)， n 为各组动物数。 【作图】 对阳性率 - 对数剂量 作图。 【思考题】 质反应的量效曲线与量反应的量效曲线有何不同？ 答案： 如以药物的效应为纵坐标，药物的剂量或浓度为横坐标作图，则得到直方双曲线；如将药物浓度或剂量改用对数值作图，则呈典型的 S形曲线，这就是通常所说的量效曲线 (图 -1)。定量阐明药物的剂量 (浓度 )与效应之间的关系，有助于了解药物作用的性质，为临床用药提供参考。药理效应是连续增减的量变，可用具体数量或最大反应的百分数表示的，称为量反应，如血压、心率、血糖浓度等，其研究对象为单一的生物单位。如果药理效应表现为反应性质的变化，而不是随着药物剂量
7、或 浓度的增减呈连续性量的变化，则称为质反应，其反应只能用全或无、阳性或阴性表示，如存活与死亡、惊厥与不惊厥等，其研究对象为一个群体。如果用累加阳性率与对数剂量 (或浓度 )作图，也呈典型的对称 S形量效曲线 (图 -2)。 附： 1、记录表格示例 1（每组用） No. Weight of body (g) Volume of injection Time: injection Time:end of observation Times of falling +/- (ml) down 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 No. Weight of body (g) Volume of
8、injection (ml) Time: injection Time:end of observation Times of falling down +/- 2、记录表格示例 2（合计）： Groups N Dose (mg/kg) Volume of injection (ml/10g体重 ) No. of reaction P% 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 注： N：每组动物数； P%：阳性反应率。 实验题目： 苯巴比妥钠和放线菌素 D 对小鼠肝脏细胞色素 P450含量的影响 Influence of Phenobarbital Sodium and A
9、ctimycin D on the Hepatic Cytochrome P-450 Content in Mice 【相关理论】 P-450 属于血红素蛋白，其还原型与 CO 结合后，在波长 450nm 处出现吸收峰。因此，可以应用示差光谱法测定其含量。肝匀浆样品中通以 CO后，加还原剂连二亚硫酸钠（ Na2S2O4），然后在 450nm 和 490nm 处测定吸光度，其差值代入公式，即可计算出细胞色素 P450 的含量。 【实验目的】 肝匀浆中细胞色素 P-450 含量的简易测定；肝药酶的诱导剂、抑制剂 的作用。 【实验动物】 小鼠（昆明种） 【实验药品】 生理盐水 NS；苯巴比妥钠 0.
10、75%；放线菌素 D（ A.D.） 0.002%；蔗糖溶液 0.25M； Tris-HCl 缓冲液。 【实验器材】 玻璃匀浆器，漏斗，试管（ 10 ml）数只，滤纸，移液管（ 10ml）数只，冰盒，扭力天平，分光光度计，制冰机等。 【实验方法】 1 动物分 3组：生理盐水组，苯巴比妥钠组，以及放线菌素 D 组。 2 苯巴比妥钠和放线菌素 D i.p.两天，诱导或抑制肝药酶。 3 断头放血：于第三天（实验当日）将小鼠断头放血（须放净 ，因血红素会影响实验结果）； 4 制备肝匀浆：将 0.25M 的蔗糖溶液和 0.05M Tris-HCl 缓冲液置于冰块中预冷；剪下肝脏（不得少于 400mg；勿破
11、坏胆囊；以滤纸吸去血迹）；扭力天平称重（垫锡纸；每次加样或加减法码时必须关上关平）；将肝组织置于匀浆器中，加入预冷后的 0.25M 蔗糖， 0.5ml/100mg 肝组织；冰浴下研磨，直至组织变为淡粉色匀浆；取此匀浆液 1ml，加入预冷后的 0.05M Tris-HCl 缓冲液 9ml，充分混匀； 218 室冰浴下充以 CO， 12 气泡 /秒，通气 2 分钟。 5 通气完毕的溶液 ，倾入 2个比色杯中，一个作为参照杯，另一个作为样品杯。向样品杯中加入连二亚硫酸钠 5mg，充分混匀。参照杯调零后，在 450nm 和 490nm处测定样品杯的吸光度。 【结果处理】 1、根据所测得的 OD 值计算
12、 P-450 的含量 *。将结果填入下表，并计算均数。 2、计算 P-450 升高百分率：（ Pheno - N.S.） / N.S.；或 P-450 降低百分率：（ N.S. - A.D.） / N.S. 【分析讨论】 1、 P-450 在药物转化中的作用原理； 答案： 细胞色素 (P-450cytochrome P-450, CYP450 或 P-450)酶系由一群基因超家族 (superfamily)编码的酶蛋白所组成 。细胞色素 P-450 参与有毒物质以及类固醇和脂肪酸的羟基化。羟基化涉及四个基本反应被氧化的物质同细胞色素P-450 结合细胞色素 P-450 中的铁原子被 NADPH
13、 还原氧同细胞色素 P-450 结合底物结合一个氧原子被氧化 ,另一个氧 原子用于形成水。 细胞中，细胞色素P450 主要分布在内质网和线粒体内膜上，作为一种末端加氧酶，参与了生物体内的甾醇类激素合成等过程。近年来，对细胞色素 P450 的结构、功能特别是对其在药物代谢中的作用的研究有了较大的进展。 2、 不同的实验组 P-450 含量不同的原因； 答案： 苯巴比妥属于酶的诱导剂， 肝药酶诱导剂是指有些药物长期使用后能加速肝药酶的合成并增强其活性，这类药物就称为肝药酶诱导剂。药酶活性增加是机体对药物产生耐受性的主要原因，因药酶活性增加，促使药物代谢加快，而使机体对药物的反应性减弱。如连续服用苯
14、巴比妥后 ，不仅使机体对苯巴比妥产生耐受性，又可使同时服用的其他药物药效减低，常需增加剂量才能维持疗效 。 3、 诱导剂增加 P-450 含量、抑制剂减少 P-450 含量的意义； 答案： 肝药酶诱导剂是指有些药物长期使用后能加速肝药酶的合成并增强其活性，这类药物就称为肝药酶诱导剂。药酶活性增加是机体对药物产生耐受性的主要原因，因药酶活性增加，促使药物代谢加快，而使机体对药物的反应性减弱。如连续服用苯巴比妥后，不仅使机体对苯巴比妥产生耐受性，又可使同时服用的其他药物药效减低，常需增加剂量才能维持疗效。使肝药酶活性减弱的药物称肝药酶抑制 剂。 药酶活性降低 促使药物代谢减慢 ，而使机体对药物 发
15、生中毒 的可能性 。 4、 肝药酶的临床意义、耐受与交叉耐受、及联合用药应注意的问题。 答案 ： 某些化学物质能提高肝微粒体药物代谢酶的活性，从而提高代谢的速率，此现象称酶的诱导。具有肝药酶诱导作用的化学物质称酶的诱导剂。酶的诱导剂能促进自身代谢，连续用药可因自身诱导而使药效降低。药酶活性增加是机体对药物产生耐受性的主要原因，因药酶活性增加，促使药物代谢加快，而使机体对药物的反应性减弱。常见的诱导剂有苯巴比妥和其他巴比妥类药物、苯妥英钠、卡马西平、利福平、水合氯醛等。 酶的诱导作用可产生两种临床后果。使治疗效果减弱：由于药酶诱导后代谢加快、加强，导致血浆药物浓度降低，从而使治疗效果减弱。例如苯
16、巴比妥是典型的酶诱导剂，它能加速华法林的代谢，使其抗凝效果降低。使治疗效果增强：甚至产生毒性反应，这主要是指那些在体内活化或产生毒性代谢物的药物。例如乙醇是肝 CYP2E1 的酶诱导剂，长期饮酒可增加对乙酰氨基酚的肝毒性。交叉耐受 cross tolerance 作为个人使用某物质的结果，而对从未接触过的另一物质产生了耐受性。这两种物质通常具有类似的药理学效应 。 联合 用药时注意 了解所服 药物是肝药酶抑制剂还是诱导剂，如果所服药物是抑制剂，那么另外 的药物要适当减量， 如果 所服药物是诱导剂，另外所服药物应加量 。 【注意事项】 1、 操作要快（为了保护酶的活性）； 2、 冰浴（为了保护酶
17、的活性）； 3、 血要放尽（ P-450 为血红素蛋白；血红素影响 P-450）； 4、 胆红素会影响 P-450 的测定； 5、 通 CO的速度不能过快或过慢； 6、 肝组织研磨到由血红色变成粉白色为止； 7、 分光光度计上比色时，先测 A.D；再测 N.S；最后测 Pheno。 【分析讨论】 1、不同的实验组 P-450 含量不 同的原因； 2、肝药酶诱导剂增加 P-450 含量、抑制剂减少 P-450 含量的意义； 附： *按下式计算 P-450 含量： P-450（ nmol/g 肝脏） = （ A450 - A490） / E L * 50000 上式中， A = ECL 其中： E
18、： P-450 从 490nm 到 450nm 波长的示差光谱消光系数，本实验中E=104/cm mmolL ； L：比色杯厚度（光路长度） “1cm。 C：溶液浓度 A：吸光度 【思考题】 1、 P-450 在药物代谢转化中的作用是什么？ 2、肝药酶诱导剂与抑制剂的临床意义 是什么？ 3、药物的耐受与交叉耐受与肝药酶有何关系？ 4、联合用药应注意哪些问题？ 实验题目： 磺胺药的药代动力学参数测算 Determination of the Pharmacokinetic Parameters for Sulfonamides 【实验目的】 了解磺胺类药物在动物体内随时间变化的代谢规律，并掌握药
19、代动力学参数的计算方法。 【相关理论】 磺胺类药物能与某些试剂发生反应生成有色物质，通过比色可以对其血浓度进行定量检测。酸性环境下，磺胺类药物的苯环上的氨基（ -NH2）离子化生成铵类（ -NH3+）化合物，与亚硝酸钠发生重氮化反应，生成重氮盐（ -N=N+-）。对这种化合物在 525nm 波长下测定其吸光度（ OD），其 OD 值与磺胺类药物的浓度呈正比。 【实验动物】 家兔， 3kg 左右。 【药品】 7.5%三氯醋酸， 0.5%亚硝酸钠， 0.5%麝香草酚， 0.1%磺胺嘧啶，肝素等。 【实验器材】 兔台，手术器械一套，动脉插管，动脉夹，离心管 10 只，试管 10 只，小烧杯（ 10ml）10只，移液管（ 0.2ml， 1ml， 5ml， 10ml）等，离心机，振荡器，分光光度计等。 【实验方法】 1 家兔麻醉后， 分离颈动脉。耳缘静脉注射肝素抗凝后，颈动脉插管，备取动脉血用。 2 取血：取空白血样。然后对家兔耳缘静脉注射磺胺嘧啶（ SD， 0.3g/kg），分别于注射后 0、 3、 5 15、 30、 45、 60、 90min 时取动脉血。 3 测定血药浓度：严格按照下表中的顺序加药：
