1、核酸疫苗,一、概 述,核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒基因直接免疫机体 ，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。,（一）概 念,（二）DNA疫苗的构成： 1. 抗原表达基因 2. 真核细胞启动子（如CMV I.E启动子） 3. Poly A 终止序列（如来自SV40 或 BGH基因） 4. 原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因） 5. 增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷),二、DNA疫苗载体,1. 裸DNA疫苗：质粒、 MIDGE载体2. 病毒载体： 天花病毒、腺病毒 3. 细菌载体：减毒活菌苗
2、和繁殖缺陷细菌，如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶尔森氏菌苗4. 微粒包裹载体：金颗粒(gold particle)、脂质体(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）、藻酸盐微粒(alginate)、和纳米微粒(nanoparticles),Various methods of gene delivery,三、DNA疫苗与常规疫苗的比较,DNA疫苗与常规疫苗比较,DNA疫苗与常规疫苗比较(续1）,DNA疫苗与常规疫苗比较(续2）,核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势：,(1)诱导机体产生全面的免疫应答，其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有
3、交叉抵御作用；(2)无减毒、灭活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性；(3)能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性；(4)与亚单位疫苗共有的高产性；(5)可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；(7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。,四、核酸疫苗诱导的免疫反应,核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应 关于核酸疫苗诱导全身免疫应答反应的机制目前了解的还不十分清楚，但其诱导过程可大致分为以下几个阶段：疫苗的摄取、转运及表达；抗原的加工和提呈；淋巴细胞的活化；免疫效应细胞和分子
4、的作用。,Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA,Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific humoural and cellular responses.,五、核酸疫苗的构建,1、将亚单位疫苗的编码基因作为核酸疫苗的候选基因。 2、多肽合成疫苗的核酸推导序列作用核酸疫苗的候选基因 3、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因 31 免疫筛选法 32 化学分解法,候选基因的筛选原则,Ligate PCR product into pTAR
5、GETTM Vector,Transform TG1 cells,Selecte recombinant clones by ampicillin,pst酶切鉴定,挑取S基因正向插入的重组质粒pTARGET-hanS测序,重组质粒pTARGET-hanS的构建:,引物1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA引物2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC,PCR,正向: 酶切成3674，1870，1470反向: 可酶切成3674，2600,740,可酶切成5.6kb和1.3kb左右两个片段,EcoR酶切,琼脂糖凝胶电泳,回收5.6kb左右的大片段,对
6、照空载体pTARGET的构建：,用连接酶连接,成为闭环pTARGET空载体,作为对照载体备用。,培养Vero-E6细胞,MEM培养基(10%FCS),37，5%CO2,细胞长至对数生长期,电穿孔转染重组质粒,转染后72h，收获细胞,检测核蛋白的瞬时表达,荧光显微镜下观察并拍照。,间接免疫荧光法,重组质粒pTARGET-hanS体外瞬间表达:,核蛋白的瞬时表达结果,pcDNA3.1+S的酶切鉴定结果,1pcDNA3.1+S 质粒（6.7kb）2pcDNA3.1+S pst酶切 （5.0kb，1.7kb）3. pcDNA3.1+S（ISS）pst酶切,作为DNA免疫的注射样品。,质粒的大量制备及纯
7、化:,按分子克隆手册所述方法提纯质粒pcDNA3.1+和 pcDNA3.1+S,用灭菌的PBS溶解,调整浓度至1.0mg/ml,用分光光度计测定A260/A280比值以确定核酸样品的纯度，A260确定样品的浓度,实验动物的DNA免疫,68W 龄的BABC/c小鼠,空白质粒pcDNA3.1+,重组质粒pcDNA3.1+S,免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理,3天后,相同部位进行DNA接种,加强免疫一次，共免疫3次。,间隔2周,细胞因子的动态变化,常规方法分离脾细胞，浓度1107,24孔细胞培养板每孔加入脾细胞悬液0.5ml，NP10l(同时设空白对照孔， ConA刺激孔)均设3个复孔,37、5%
8、CO2孵箱培养48小时后,收集脾细胞上清液，贮于-70，统一用ELISA kits 检测IL-4和IFN-,分别于免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d每组处死3只小鼠,淋巴细胞增殖反应:,脾细胞取自初次免疫后42d的免疫鼠,以重组的核蛋白刺激免疫小鼠的脾细胞,阴性对照孔和阳性对照孔(ConA),用MTT法检测脾细胞的增殖反应，计算刺激指数（SI）,常规方法分离脾细胞,浓度调整至2106,免疫鼠血清的抗NP抗体的测定:,免疫前和免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d经尾静脉采血,N=6/group,以被检标本复孔（3孔）OD值与免疫前血清（阴性对照）的比值2.1者为阳性。,
9、重组的NP作为包被物，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗,ELISA法检测血清的抗NP抗体,血清抗NP抗体滴度的测定:,将初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血,N=6/group,留置血清，以10倍稀释为起点,再做系列稀释,ELISA法,检测血清抗体滴度,六、核酸疫苗的优化,1、免疫效果的优化,选择高效表达载体添加DNA免疫激活序列,2、免疫途径的优化,肌肉注射（im）,基因枪导入,皮内(id)和皮下(sc)注射,黏膜表面接种,Effects of CpG motifs on various cells,Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs,2、免疫途径的优化,3、基因佐剂的应用,细胞因子类共刺激分子分子佐剂联合,4、抗原蛋白的泛素化表达,IL-12、IL-15、IL-18及IFN-以增强Th1型细胞应答为主。 IL-4加强体液免疫,IL-2能同时加强体液免疫和细胞免疫 集落刺激因子,5、与基因重组疫苗联合应用,细胞因子产生的动态变化,
