1、胡萝卜根的离体培养,成 都 师 范 学 院,外植体的取材、消毒和培养技术,无籽西瓜,成 都 师 范 学 院,如 何 繁 殖？,成 都 师 范 学 院,植物组织,愈伤组织,长出丛芽,长根,完整植株,成 都 师 范 学 院,在 下，把植物体的器官或组织片段切下来，接种在适当的 上进行离体培养，这些器官或组织的细胞就会经过 和 的过程，逐渐产生出植物的各种组织和器官，进而发育成 。,无菌条件,人工培养基,脱分化,再分化,一颗完整的植株,植物细胞的全能性,成 都 师 范 学 院,用于离体培养的植物器官或组织片段，叫做外植体,选择外植体的原则,分生能力强无病毒苗,成 都 师 范 学 院,外植体必须使用无
2、菌材料整个组培流程也必须无菌,如何创造组织培养无菌的条件,成 都 师 范 学 院,1、操作房间、操作流程的无菌,2、操作人员的消毒,3、接种器械的消毒灭菌,4、外植体消毒灭菌,1、操作房间、操作流程的无菌,接种室的消毒超净工作台的消毒,成 都 师 范 学 院,甲醛高锰酸钾熏蒸,高锰酸钾与甲醛反应，缓慢放热，促进甲醛挥发，杀灭物体表面和空气中的细菌繁殖体,紫外线杀菌,使细菌核酸突变，生产蛋白质能力丢失，导致细菌死亡。,成 都 师 范 学 院,紫外灯开启杀菌,杀菌结束，白炽灯开启工作,2、操作人员的消毒,a.操作人员进入无菌接种室需要穿白大褂，在无菌室禁止交谈b.接种前，操作者要用肥皂清洗双手，擦
3、干,成 都 师 范 学 院,c.操作者进入接种室后，用酒精棉球擦拭双手及操作台面,成 都 师 范 学 院,3、接种器械的消毒灭菌,灼烧灭菌 镊子、剪刀、解剖刀等侵入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯上灼烧灭菌,成 都 师 范 学 院,使用注意：通过高温杀灭细菌，冷却后立即使用，每次接触外植体后需要重新灼烧。,利用酒精灯的外焰,常用消毒剂：75%的乙醇及10%的次氯酸钠消毒的原则：,成 都 师 范 学 院,4、外植体消毒灭菌,1）消毒剂与外植体应该接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。,2）灭菌时间从倒入消毒液开始计时，至倒入无菌水为止,3）灭菌液要充分侵没
4、材料。,胡萝卜根的离体培养,选取对象： P-木质部、C-形成层、 X-韧皮部,成 都 师 范 学 院,C-形成层,为什么选取形成层？,成 都 师 范 学 院,形成层的细胞分裂能力强，且基本不携带病毒.全能性也相对比较高。,1.清洗清水洗净胡萝卜去掉表皮把胡萝卜切成3cm的段,成 都 师 范 学 院,（一）胡萝卜根的消毒灭菌,2.消毒向带有螺口盖的玻璃瓶中倒入适量的75%的酒精，取胡萝卜条，侵入75%的酒精中，30s后倒出酒精。,成 都 师 范 学 院,（一）胡萝卜根的消毒灭菌,75%酒精,3.灭菌向玻璃瓶中倒入10%的次氯酸钠溶液，拧上瓶盖，消毒5-10min。,成 都 师 范 学 院,消毒期
5、间，要将玻璃瓶摇动2-3次。,（一）胡萝卜根的消毒灭菌,10%次氯酸钠,4.洗掉消毒剂消毒后，打开瓶盖，将消毒液倒入烧杯中，在玻璃瓶中加入适量的无菌水，盖上瓶盖，摇动数次，将水倒去。重复3-4次，用无菌滤纸将胡萝卜段表面的水吸干。,成 都 师 范 学 院,（一）胡萝卜根的消毒灭菌,1. 打孔将消毒的胡萝卜段放入无菌培养皿中，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的3cm的圆柱体。,成 都 师 范 学 院,（二）接 种,（二）接 种,2. 切割用消毒后的解剖刀截去两头越1cm长度的与消毒剂接触的胡萝卜段，余下部分沿截面将其横切成1mm左右的小圆片。,成 都 师 范 学 院,3
6、. 接种到培养基将切好的胡萝卜的外植体迅速接种在MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA的固体培养基上。,成 都 师 范 学 院,（二）接 种,3. 接种每个培养瓶可接种4-6块外植体，注意培养瓶口应斜向火焰。,成 都 师 范 学 院,（二）接 种,（三）接 种,成 都 师 范 学 院,3. 接种材料接种好后，将培养瓶的瓶口在酒精灯火焰上转动灼烧一遍，拧紧瓶盖，以免微生物进入，造成污染，导致培养失败，,（三）接 种,成 都 师 范 学 院,4.标记接种完成后，在瓶壁上贴上标签，注明接种材料的名称、编号和接种日期。,操 作 示 例,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,成 都 师 范 学 院,
