1、食品卫生微生物学检验的质量控制摘要：本文从检验人员的质量控制、环境和设施的质量控制、仪器设备的质量控制、培养基与关键试剂的质量控制、抽样与样品处理的质量控制、检验过程的质量控制、结果报告的质量控制、实验室内外部的质量控制等方面，讨论如何加强微生物检验的质量控制来提高结果的准确性。 关键词：食品 微生物学检验 质量安全 质量控制 Quality control of microbiological examination of food hygiene Xing zeng wei1， You yong lai2， Liu ying3， Liang shao ming4 （1 Guangdong
2、Lingnan Institute of Technology； 2 Conghua Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau； 3 Guangdong Vocational College of Environmental Protection Engineering Foshan； 4 Yaneng Bioscience （shenzhen） Co.，Ltd.） Abstract： In this paper， how to enhance the quality control of microbiological analysis is
3、 discussed to improve the accuracy of result based on the following factors. These factors include analysts， laboratory environment， instruments and equipments， culture and key reagent， sampling and pretreatment， analysis process， result and report， laboratory inside and outside and so on. Key words
4、： Food； microbiological examination； quality safety； quality control 随着对外贸易的蓬勃发展，进出口食品数量日益增加，国内外消费者对食品的质量提出了更高的要求，对食品的安全卫生问题日趋重视。通过加强微生物检验质量控制，可提高检测结果的可信度，及时地反应出产品的卫生状况，及早发现微生物的污染，并采取有效措施防止微生物危害，进一步用于监管部门监督生产，保证食品安全，对防止卫生不合格的食品进出口、保护消费者健康、维护“中国制造”的声誉有着十分重要的意义1。同时也便于实验室及时发现检测过程中存在的问题，及时分析原因并解决问题，为量值溯
5、源、纠正预防措施的实施提供见证，帮助完善实验室质量管理，提高检测水平等。中国合格评定国家认可委员会（英文缩写：CNAS）在检测和校准实验室能力认可准则中明确规定实验室应有质量控制程序以监控检测和校准的有效性2。检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明就质量控制活动也作出明确的规定3。虽然国家标准和出入境检验检疫行业标准对食品卫生微生物学部分在方法、步骤等方面作了详细的规定，但在实际检验中还存在着许多复杂的因素，如果忽视这些因素，很可能给检验结果带来偏差甚至错误，从而无法正确判断产品的卫生状况，如何控制这些影响因素以保证检验结果准确性是日常检验中必须实施的工作即食品卫生微生物学检验
6、的质量控制。 本文从检验人员的质量控制、环境和设施的质量控制、仪器设备的质量控制、培养基与关键试剂的质量控制、抽样与样品处理的质量控制、检验过程的质量控制、结果报告的质量控制、实验室内外部的质量控制等方面，讨论如何加强食品卫生微生物学检验的质量控制来提高结果的准确性。 1、检验人员的质量控制 微生物检验人员，必须具有严肃、认真的工作态度，具有较强的工作责任感，观察事物要细致，有发现问题、解决问题的能力，身体健康、无不良的卫生习惯4。实验室管理者应对各岗位人员进行授权，对从事微生物检验人员要求其具有的技术知识和经历应能与其承担的任务相适应，具备较强的“无菌”意识，熟练掌握微生物检验技术，对报告进
7、行审核和签发的技术管理者要求必须精通微生物学的全面知识。 检验人员应参加岗前培训，包括检测技术培训、仪器设备使用维护保养培训等，考核合格后方能上岗操作，平时还应经常参加各类培训班、讲座、研讨会等，提高检测技术水平，及时了解微生物检验的新技术和新方法。检验人员应掌握国家食品卫生微生物学检验方法、标准及相关法律法规，熟悉基本的计量学知识、计量标准、计量法令和法规以及有关的质量保证体系知识，能正确使用法定计量单位，参加各类比对试验和盲样测试，提高分析问题、解决问题的能力。定期对检验人员进行考核，实验室也应指定专人对检测人员的工作实施适当而且有效的监督，确保这些人员能依据实验室的管理体系要求胜任其担任
8、的工作，不断提高检验人员的素质。 2、环境和设施的质量控制 微生物检验室的设计原则应减少潜在的对检验人员的危害和对被检样品的污染。检验室布局宜采用单方向工作流程，避免交叉污染。检验区与办公区分开，洗涤室、培养室、消毒间、无菌室应分开，无菌室的人流通道与物流通道应分开，采取有效的隔离措施并有明显的标识，进行病原微生物分离鉴定工作应按要求配置二级生物安全检验室（BSL-2） ，确保所有检测环境都有利于其工作的正确进行。 微生物检验室应备有紫外灯、自动感应洗手消毒装置或脚踩式洗手消毒设施，有条件的无菌室应配置风淋装置，配有缓冲间，最好设置推拉门，以防止空气震荡太大。检验人员进入无菌室前应穿戴已灭菌的
9、工作衣、帽、口罩，在检验任务未完成前不得随便进出无菌室。 定期对操作环境进行消毒并监控消毒效果，无菌室采用紫外灯灭菌或其他有效的方法，超净工作台需提前半小时开机，当环境不符合要求时，应立即停止检测工作直到环境恢复到满足要求为止。 微生物检验室应制定完善的卫生管理制度，工作人员必须每天坚持做好环境卫生工作，检验结束及时清理余物，做好所用工器具和台面的清洁消毒工作。实验废弃物应及时清理，所有弃置的实验室生物样本、培养物和被污染的废弃物必须通过高压消毒或其他认可的方法处理，达到生物学安全后，方可运出实验室。 3、仪器设备的质量控制 微生物检验中常用到的仪器设备有高压灭菌器、干热灭菌器、电子天平、显微
10、镜、生化培养箱、超净工作台、生物安全柜等，仪器设备应建立使用维护保养操作规程。仪器设备使用人应依照操作规程进行操作并做好登记。如果温度直接影响分析结果或对设备的正确性能来说是至关重要的，实验室应定时监控这类设备的运行温度，并做好记录。高压灭菌器应使用相应指示条监控设备的灭菌效果并做好记录。仪器设备应定期维护保养，确保其良好工作状态。生化培养箱、超净工作台、生物安全柜等设备还应定期清洁并充分杀菌，以防杂菌污染影响结果的判断。计量器具如电子天平、高压蒸汽灭菌器的压力表、培养箱与冰箱的温度计等应定期委托有资质的计量部门进行校准或检定，校准或检定合格在有效期内使用，计量器具校准或检定应建立档案以备溯源
11、。对某些使用非常频繁或性能不够稳定，对检测结果的准确度和有效性有影响的仪器设备，使用者应定期按仪器设备的相关规定进行期间核查或校准。对于贵重仪器和设备，在使用前应加以检查，使用后要登记，要作到定期维护，以保证仪器处于良好的工作状态5。 仪器设备的状态应正确对其标识，防止使用有故障的仪器设备。无菌工器具和器皿应按规定存放在指定的区域并标识，与非无菌工器具和器皿加以区别。经生物污染后的仪器设备应标识以防误用。 4、培养基和关键试剂的质量控制 4.1 培养基的质量控制 食品微生物学检验中用的培养基、染色液、指示剂等严格按照国家标准 GB4789.28-2003 规定的方法进行配制6，各种试剂纯度应在
12、分析纯级以上。制备培养基必须在玻璃容器、搪瓷缸或铝锅中进行，不宜采用铜或铁器皿，否则会抑制微生物的生长，配制时应按国标规定的配方和顺序添加，使用蒸馏水或去离子水，避免使用自来水，配制完毕还应按国标规定调整 pH 值，一般用 1mol/L 的盐酸或氢氧化钠进行调节，避免使用浓酸/碱以免破坏培养基成分，配制好的培养基应及时杀菌并尽快使用，使用不完的，如无特殊需求，可室温或低温 2-8保存，如用塑料袋密封，保存期可延长，有长菌、产酸、产气等被污染迹象或干裂现象的则不能再使用。 新购入的培养基或每批新配制好的培养基在使用前，应用参考菌株做验证试验和无菌培养。验证试验是指按不同的培养基接种相应的参考菌株
13、，观察菌株在此培养基上的生长、菌落形态、生化、动力学、溶血等特征，看特征现象是否明显，据此判断培养基是否符合要求。无菌培养是指将已灭菌的培养基放入 37的培养箱培养 48h（对于细菌培养基）或放入 28的培养箱中培养 5-7 天（对于细菌培养基以外的其他培养基如霉菌用培养基） ，以检查灭菌是否彻底。 目前，微生物检验中普遍采用的是成品干粉培养基，采购这些干粉培养基应注意：（1）干粉培养基必须是专业正规厂家生产，产品质量必须符合有关的国家标准或企业标准，购买时应索取相应的资质证明和检验报告。 （2）干粉易受潮结块变性，保存应符合相关要求。为保证干粉培养基质量指标，在实际使用时尽量缩短开盖时间，加
14、强包装的密封性能，一般干性培养基放在低温干燥的环境中如冰箱的冷藏室保存，对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存并尽快短时间内使用完毕，由于配制水分不同或启用次数增加，干粉培养基的 pH 值可能会有所变化，最后应随时略加调整。 （3）购入商品化即用型培养基应注意：为保证培养基的质量，生产时一般采用真空包装，购入时应对其外观检查，检查包装袋是否破损漏气，培养基是否开裂、平皿有无破碎、血平板有否溶血、有否冰冻、倾注是否均匀、有否过多的气泡等，清晰度和有无污染也需要检查，还要向厂家索取相应的资质证明和检验验证报告，使用时可不必对培养基进行大量的验证工作，但应保证其储存条件。 4.2 关键试剂的质量
15、控制 微生物检验用的相关试剂纯度也要求在分析纯（AR）级以上，在利用药品、试剂配制染色液、缓冲液及其他试剂时应注意：按要求选取溶剂，用带塞的试剂瓶盛装，易分解的试剂宜用棕色瓶，挥发性的试剂瓶口应予密封，如发现溶液有变质现象，应停止使用，标准溶液应定期标定。实验室内保存的试剂应定期进行清点，陈旧或损坏的试剂应弃去，注意保存试剂的使用有效期以及最佳保存方式。染色液配制后，必须选用适当的参考菌株作阳性及阴性对照来鉴定染色液的性能。 致病菌鉴定分型使用到的生化诊断试剂和血清应从正规生物试剂厂家购买，使用时应注意试剂及血清的有效期，使用前用相应的参考菌株做确证试验，合格后方可使用。过期血清和变混浊的血清
16、不应继续使用。血清一般保存在普通冰箱的冷藏室内，切忌冻结，使用时应尽量短时间暴露于空气中，以免污染。 试验用参考菌株必须从认可的菌种收集途径获得，购入时应索取相应的证明材料。参考菌株必须保存于带锁冰箱中，双人双锁制度，确保菌株安全。购买的菌株必须用验证合格的培养基做确认试验，按购买的菌株不同形态（干粉、冻存管） ，在肉汤或血平板上复苏、鉴定后使用。参考菌株应于规定时间内传代并进行确认，注意菌株有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。 5、抽样和样品的质量控制 整批食品的微生物学卫生状况是通过对样品的微生物学检验来评价的，因此，抽样十分重要。抽样时应注意如下问题7：（1）抽样工具和容器宜
17、选用耐消毒灭菌的材料，如玻璃、不锈钢、牛皮纸等，使用之前应进行认真清洗、干燥和灭菌处理，但不能用消毒剂消毒，样品中不得加入防腐剂，以免影响结果的正确性。抽样可使用一次性无菌样品袋采集。 （2）在严格无菌操作的条件下，按国标 GB4789.1-2008 均匀而准确地抽样，及时封口，使样品具有准确性和代表性。 （3）每件样品封口后，贴上标签，做好记录（如样品名称、采样地点、时间、数量、抽样或送检单位及姓名，及卫生状况等） 。采集后的样品应及时送检，如果样品是冷藏食品，应保持冷链送检。 （4）抽样数量不能少于全部检验需要量的 3 倍，以供检验、复检、备查。 微生物检验室在收到送检单和样品后，接样人应
18、认真核对登记并注明样品的检测状态，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。微生物检验室应按检验要求及时准备条件、组织力量进行检验。送检的样品如无法及时检验，微生物检验室应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。一般样品宜保持在 0-5的冰箱中，对于冷冻食品应保持在冷冻状态，直到检验为止，冷冻样品应尽快放在冷藏的温度下解冻。从容器中取出样品、称取样品及预处理均应遵循无菌操作原则，防止污染。 检验后样品的保存，保存条件和保存时间应按规定执行，保存期满后按有关规定处理样品。对检出致病菌的样品要经过无害化处理，一般采用高压灭菌，确保样品中致病菌不会传播扩散。 6
19、、检验的质量控制 检验方法一般采用国家标准和出入境检验检疫行业标准，如果样品送检时客户制定了其他的检验方法，则需利用参考菌株对检验方法做确证试验。除按国家标准方法对所需检验项目进行检测外，在实际工作中还应 注意以下几个方面，否则会影响检验结果的准确性：（1）在定量检验时样品一般采用重量法或体积法称量，但两者的检验结果存在一定的误差，因为比重不等于 1 的样品，lmL 和 1g 的样品检验结果绝不会相等。一般固态的样品宜用重量法，液体样品宜用体积法。但对于黏性液体（如调味酱） ，如用体积法，会粘附一定量的样品在吸管上，因此此类样品最好用重量法。 （2）如样品需用无菌水或无菌生理盐水稀释，最好用均
20、质器或组织捣碎机制成均匀的菌悬液。 （3）如样品含油脂成分较高，直接使用无菌生理盐水稀释不能制成均匀的菌悬液，可在配制生理盐水时加入少量适当的乳化剂一同灭菌，这样当样品稀释时就易制成均匀的菌悬液。 （4）样品稀释时，常会滞留少量样品在吸管壁内外，应多加注意。吸管插入样品或稀释液中应深浅一致，否则会影响检验结果，吸入液体后，应沿管壁慢慢注入递增的稀释液中，特别注意此时吸管尖端切不可碰到稀释液中。每递增稀释一次，即换用一支灭菌吸管。 （5）在培养基倾注入检样、菌悬液时，注意培养基温度宜在 45-50之间，并使培养基与检样、菌悬液充分混合。 （6）微生物培养时，应根据微生物生产的特性选择正确的培养温
21、度和时间。 （7）应用无菌水或无菌生理盐水作空白对照，如果在空白对照中检出细菌，则可认为培养基质量存在问题或在操作过程中存在污染情况。另外，采用参考菌株作阳性对照，观察培养基的质量情况。 （8）整个检验过程应严格遵守无菌操作。 （9）及时检查结果，做好原始数据记录。 7、结果报告的质量控制 7.1 对原始数据进行计算整理，去除不必要的误差，获得准确的数据，处理某些检测项目数据时还应考虑检测结果的不确定度如菌落总数；7.2 编制检验报告要求：主题明确符合检样要求和分析目的；内容准确定性判断和定量计算应准确无误；文字简明文字、表格简洁明了，表达适当；书写清楚菌类名称（学名） 、有关数字及其它文字说明必须书写清楚。 7.3 检验结果应按照标准的要求进行报告：（1）定量检测如在 100以内，按“四舍五入”的原则修约，按二位有效数字报告，大于 100 时，以 N10n 表示，N 为按“四舍五入”原则修约后的两位有效数字；（2）对定性检测的报告，应用汉字“25g 样品中检出或未检出菌”或标准要求的其它方式表示。 （3）在做大肠菌群检验时如最低稀释度为100（即在 3 支双料 LST 肉汤管中每支接种 10 -1 样品匀液 10mL） ，查标准中大肠菌群最可能数（MPN）检索表时应将表内数字相应降低 10 倍报
