1、流式细胞术Flow Cytometry（FCM）,概 述,流式细胞技术的发展1930s1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞,结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动数器。） 1960s晚期发展：（荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ，1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。）仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。,流式细胞仪技术在医学与生物
2、学中的应用,流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得到广泛的应用。,FCM基本结构,1.激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)2.液流系统3.计算机处理系统,FCM结构图,1. 激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)原理示意图,光学系统 F
3、CM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。,2. 液流系统,流动室,激光聚焦,激光波长: 488nm, 635nm,3.流式细胞仪工作原理,提 要,流式细胞仪使用的基本知识流式细胞仪检测的生物学意义流式细胞仪检测在临床诊断的应用,1 流式细胞仪使用的基本知识,前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义荧光素的选择检测通道的确定自发荧光的产生消除非特异性结合-FcR阻断对照的设置多色荧光补偿的调节设门的意义样品处理的要求,FSC和SSC的原理,前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义,前向散射光,侧向散射光,血细胞双参数点图
4、,Fluorescein Isothiocyanate (FITC)异硫氰酸荧光素Phycoerythrin (PE)藻红素Allophycocyanin (APC)异藻蓝蛋白Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)多甲藻黄素-叶绿素蛋白Tandem DyesPE-Texas Red (ECD)PE-Cy5 (PC5)PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE-Cy7 (PC7) (futures)Propidium iodide（PI ）碘化丙碇,常用荧光染料(488nm,633nm激发),荧光素的选择：荧光强度FITCPEAPC依次增加；弱信
5、号采用PE或APC，强信号采用FITC,荧光素的选择,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 红色APC 633 670 免疫荧光 红色PI 488 620 DNA染色 橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红色,通道 发射波长 荧光颜色FL1 530/30 绿色 FL2 585/42 橙色FL3 650 橙红FL4 661/16 红色FL2 - Area FL2 - Width,检测通道的
6、确定,自发荧光的产生,末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。,消除非特异性结合-FcR阻断,对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂(纯化的抗FcII/III受体抗体)减少非特异性荧光染色；对于人和兔细胞可以应
7、用纯化同种的Ig或血清预先阻断Fc受体,对照的设置,细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同；细胞内细胞因子检测,可设阳性对照细胞。,激发光源与荧光标记物示意图,光谱重叠示意图,荧光补偿,流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片系统最大限度地减少这些信号。色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，典型例子是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。,光谱
8、重叠的校正的示意图,多色荧光补偿的调节,两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。,设门的意义,细胞类型或亚型的鉴定特殊蛋白质的分析细胞的分选,细胞分选前后示意图,标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。反应温度：2627C，
9、室温避光。细胞处理：,样品处理的要求,细胞处理：细胞固定和膜通透,抗体滴度,检测细胞内的细胞因子表达，细胞必须在穿透细胞膜前被固定，以维持细胞的结构完整性；细胞固定选用70%乙醇 4%(w/v) paraformaldehyde（中性pH, PBS缓冲液);细胞穿透选用去污剂0.2%Triton X-100;应用抗体标记的缓冲液含代谢抑制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗体结合引起的细胞膜蛋白的再分布由于荧光素结合抗体容易产生高水平的非特异背景信号，最好预先测定最佳抗体浓度，否则存在假阳性,流式细胞仪检测的生物学意义,免疫细胞的鉴定及表型分析细胞表面蛋白质及细胞内因子含量的测定细胞周期的分析
10、,免疫细胞的鉴定及表型分析,免疫表型：利用荧光染料标记抗体识别细胞抗原 ，识别细胞亚群的标志。,白细胞簇分化抗原(Cluster Differentiation Antigen，CD)系统,1984年首届国际人类白细胞分化抗原会，对T细胞分化抗原命名，建立了CD命名系统。利用抗原相应的单克隆抗体结合的荧光染料，识别组织细胞上不同的CD分子。,NK细胞和T淋巴细胞亚群,Th1和Th2细胞,细胞表面蛋白质及细胞内因子含量的测定,细胞周期的分析,食管癌细胞株的细胞周期,流式细胞仪检测在临床诊断的应用,在临床细胞免疫学中的应用在临床血液学中的应用 在临床肿瘤学中的应用,FCM在临床细胞免疫学中的应用,
11、淋巴细胞表面标志的检测 淋巴细胞分为：T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞，T 淋巴细胞免疫标志为 CD3、CD4、CD8 , B 淋巴细胞免疫标志是 CD19 , 自然杀伤（NK)细胞免疫标志(CD16、CD56) , 记忆 T 细胞主要免疫标志(CD4、CD45RO) , 天然T 细胞主要免疫标志( CD4、CD45RA) , 调节性T细胞主要免疫标志(CD4、CD25) , 树突状细胞主要免疫标志( CD11c、CD123) 。通过FCM对淋巴细胞免疫表型的分析,不仅能了解淋巴细胞的分化及其功能,鉴别新的淋巴细胞亚群,而且通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某些细胞表面标志的存在、缺乏、过度
12、表达等,对免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病的诊断和治疗，免疫功能的重建和器官移植等均有重要的临床意义。,T淋巴细胞的Th和Ts细胞亚群,NK细胞和B淋巴细胞亚群,细胞内细胞因子的测定 检测细胞因子对于临床上某些疾病的诊断和治疗具有重要的意义。其方法主要是通过细胞因子的特异性单克隆抗体进行细胞内免疫荧光染色,并结合膜表面抗原染色, 用多重染色FCM分析各种细胞内合成的细胞因子, 并根据各类细胞所产生的细胞因子种类的差别, 对免疫细胞进行分类, 如辅助性T细胞(Th1、Th2) 。因此，FCM 对活化免疫细胞内的细胞因子的检测，不仅能分析细胞因子的含量和产生细胞因子的不同细胞亚群,还能了解细胞内细胞因
13、子产生的动力学机制。,细胞内细胞因子的意义,细胞因子决定免疫效应细胞的构成和形成介导免疫功能的转化(保护性免疫和对病原体的炎症反应)任何异常调节形式将导致免疫病理状态：免疫缺陷或自身免疫在健康和疾病中起非常重要作用，是临床和基础研究的重点,Th1/Th2细胞的检测及应用,一系列表达细胞因子的特定细胞群：T、B、NK和单核巨噬细胞系统；I型细胞涉及细胞介导的免疫反应，迟发过敏反应、巨噬细胞活化、下调II型反应，病毒、某些细菌刺激；II型细胞涉及体液免疫反应，B细胞增生、多克隆Ig分泌、下调I型反应，原虫、过敏原刺激。,FCM在临床血液学中的应用,血细胞的来源血液疾病的检测造血干细胞检测,急性B淋
14、巴细胞性白血病,血液疾病的检测,CD34+CD19+CD33-CD13-,CD34+CD33+CD13+型粒细胞性白血病,造血干细胞检测,造血干细胞移植是目前治疗白血病和其它恶性肿瘤及遗传性疾病的有效方法之一造血干细胞的来源：骨髓、动员的外周血单个核细胞、脐带血等目前采用的造血干细胞检测包括：CFU-GM、CFU-G等功能检测；CD34细胞计数。CD34抗原是85年代中期发现的细胞膜分子，存在于幼稚造血干细胞和所有集落形成单位细胞膜上，包括定向和多能祖细胞CD34+细胞占正常骨髓单个核细胞群体的14%外周血小于0.1%增强测定CD34+细胞的数量对造血干细胞移植非常重要CD34+的定量分析应用
15、于动员过程、外周血白细胞分离过程中和分离后的监测。,细胞处理,CD34+阳性细胞绝对计数,对于微量细胞的分析，去除背景信号或细胞碎片非常重要利用核酸染料(FL-1)能够识别完全的有核细胞，如白细胞和有核红细胞；去除细胞碎片、成熟红细胞、血小板 造血祖细胞CD45弱阳性，利用CD45-PerCP/SSC去除淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、聚集血小板和有核红细胞CD34-PE抗体标记造血祖细胞IgG1-PE作为阴性对照,左图根据核酸染料(FL1)去除细胞碎片确定祖细胞位置中图依据CD45染色(FL3)减少CD45强阳性细胞；同时根据SSC去除非祖细胞的高SSC细胞；右图显示R1和R2
16、区的细胞及R3的标准珠；通过FL1/FL2清晰区分出CD34+细胞群；根据R3区的数量计算CD34+细胞的绝对数。 R4R35170050ul,FCM在临床肿瘤学中的应用,利用FCM检测染有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）的细胞，对肿瘤细胞DNA含量作出定量分析,通过研究细胞的周期变化及细胞异倍体的测定,预测各种肿瘤治疗的预后；在肿瘤化疗中对药物的选择，及放疗中对强度、时间的决定等起着指导作用；解释抗癌药物的作用机制；对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定的参考价值。而且，FCM 对细胞凋亡、抗凋亡蛋白质、周期蛋白、癌基因、抗癌基因的研究，均可揭示肿瘤的发生、发展机制；并对肿瘤
17、预防、治疗和预后的评价等方面起着重要的作用。,凋亡细胞,特性： 细胞内的内切核酸酶的激活，导致细胞中低分子量DNA的出现,进而减少了DNA的特异的荧光染色。 凋亡的细胞具有完整的细胞膜，对碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染料具有排斥反应。 早期的细胞凋亡表现为细胞膜的不对称的丢失，即磷脂丝氨酸残基在质膜内外层分布的改变。利用一种抗凝结蛋白（Annexin V，既能优先与负离子的磷脂如磷脂酰丝氨酸结合，又能与荧光染料结合）的亲合性进行检测。,凋亡细胞流式细胞仪的分析方法,Annexin 分析PI染色分析DNA断片的分析,Annexin 分析原理,Annexin 分析图,PI 染色原理,PI(碘化丙啶,Propidium iodide)是一种插 入性的荧光染料，能够嵌入双链核酸（DNA和RNA）的碱基对中，经RNA酶的处理后，细胞中的RNA被消化掉，PI可对DNA进行特异的染色。,PI染色分析,DNA 断片的分析原理,PI-FITC 双标记,FITC-BRDU标记DNA断片,
